Name: Protokoły doustnego zakażenia larw Lepidoptera bakulowirusem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-03T23:29:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Poznaj techniki doustnego zakażenia larw Lepidoptera bakulowirusem w celu oceny skuteczności insektycydowej. Metody obejmują bioasay z kroplowym karmieniem i wtyczkami pokarmowymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Aby dowiedzieć się więcej o modyfikowaniu baculowirusów jako środka owadobójczego oraz o technikach infekcji doustnej stosowanych w tym badaniu, prosimy odwiedzić stronę <a href="http://www.springerprotocols.com/Abstract/doi/10.1007/978-1-59745-457-5_18">Springer Protocols</a>.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

protokoły doustnej infekcji larw motyli z rzędu lepidoptera wirusem z grupy baculoviridae

Protocols for Oral Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

Bakulowirusy są szeroko stosowane zarówno jako wektory ekspresji białek, jak i środki do zwalczania szkodników owadzich. W niniejszym filmie pokazano, w jaki sposób larwy motyli można zakażać polihidrami za pomocą metody kroplowej oraz bioanaliz opartych na pożywkach w formie wtyczek. Towarzysząca temu sekcja Springer Protocols zawiera przegląd cyklu życiowego bakulowirusów oraz ich zastosowania jako środków owadobójczych, w tym omówienie zalet i wad wykorzystania bakulowirusów jako insektycydów, a także postępów w genetycznym ulepszaniu bakulowirusów w celu zwiększenia ich skuteczności owadobójczej.

W niniejszym filmie prezentujemy techniki infekcji doustnej larw motyli z rzędu Lepidoptera wirusem z rodzaju baculovirus w celu określenia efektywności owadobójczej.

Protokoły doustnej infekcji larw motyli z rzędu Lepidoptera wirusem z grupy Baculoviridae

Bakulowirusy są szeroko stosowane zarówno jako wektory ekspresji białek, jak i środki do zwalczania szkodników owadziego pochodzenia. W tym filmie pokazano, w jaki sposób larwy motyli mogą zostać...

Wirus Vao jest powszechnie stosowany jako wektor DNA w połączeniu z liniami komórkowymi owadów do ekspresji białek. Jednak fakt, że wirus ten skutecznie infekuje owady, prowadząc do ich śmierci, sprawia, że jest on również efektywnym środkiem owadobójczym. W Brazylii, na przykład, dziki typ wirusa Balo jest stosowany corocznie na ponad 1 mln hektarów upraw soi w celu zwalczania gąsienicy fasoli aksamitnej. Aby zwiększyć ich skuteczność owadobójczą, wirusy Balo zostały zmodyfikowane genetycznie poprzez wprowadzenie genów kodujących specyficzne dla owadów toksyny, które wykazują aktywność w hemosil owada.W tym filmie prezentujemy metody infekcji doustnej larw motyli z rzędu Lepidoptera wirusem baculovirus w celu analizy skuteczności owadobójczej. Witajcie, jestem z laboratorium Blind Boning w Katedrze Okulistyki na Uniwersytecie Stanowym Iowa, a ja jestem Wendy Sparks, również z laboratorium Boning. Dziś przedstawimy dwie procedury infekcji larw Lepidoptera wirusem baculovirus.Najpierw pokażę Państwu, jak przeprowadzić zakażenie larw noworodkowych z wykorzystaniem bioanalizy metodą karmienia kropelkowego. Następnie zaprezentuję sposób zakażania larw w późniejszych stadiach rozwojowych przy użyciu bioanalizy z wykorzystaniem pożywki z krwią. Zatem zacznijmy.Bioanalizy z wykorzystaniem żerowania z kropel mogą być stosowane do wyznaczania dawki śmiertelnej abakawiru oraz przeżywalności larw zainfekowanych wirusem balo w czasie. Do tego badania zazwyczaj wykorzystuje się larwy wczesnych stadiów rozwojowych lub nowonarodzone.Przed rozpoczęciem upewnij się, że masz pod ręką kubki z odpowiednią dietą. Przygotuj również odpowiednie rozcieńczenia wirusa, dodając zielony barwnik spożywczy do stężenia 4% objętościowo. Aby określić letalną koncentrację wirusa, rozcieńczenie powinno zapewnić zakres śmiertelności od 1 do 99%. Może być wymagane przeprowadzenie wstępnych biotestów w celu ustalenia odpowiedniego zakresu stężeń wirusa. Po wymieszaniu probówki w wirówce laboratoryjnej (vortex), aby zapobiec sedymentacji poliedrów, nanieś dwa koncentryczne kręgi z małych kropel roztworu wirusa na szalkę Petriego o średnicy 60 milimetrów.Dla każdego użytego stężenia wirusa należy przygotować również negatywną kontrolę z pozorną infekcją (mock infection). Następnie, przenosząc osobniki do opracowania, przenieś od 25 do 30 larw noworodków do środkowej części koncentrycznych kręgów za pomocą sterylnego pędzla. Nałóż pokrywkę nay szalkę i uszczelnij ją paraformą, aby zapobiec ucieczce larw.W idealnym przypadku należy używać różnych pędzli do przenoszenia każdego rodzaju wirusa, aby zapobiec kontaminacji między grupami badawczymi. Pozostawić szalkę w temperaturze pokojowej na 10 do 15 minut, aby larwy mogły się napić. Larwy, które przyjmowały pokarm, można zidentyfikować po zielonym zabarwieniu przedniej części jelita wynikającym z zastosowania zielonego barwnika spożywczego. Przenieść jedynie larwy, które żerowały, do plastikowych kubków o pojemności jednej uncji zawierających pożywkę, umieszczając jedną larwę w każdym kubku.Po przeniesieniu larw przykryć naczynia pokrywkami i inkubować w temperaturze 28°C przez 24 godziny po zakażeniu. Usunąć wszystkie naczynia zawierające martwe larwy. Te wczesne zgony wynikają prawdopodobnie z obrażeń powstałych podczas manipulacji.Podczas stosowania tego testu biologicznego w celu wyznaczenia dawki letalnej, larwy należy sprawdzać co dwa lub trzy dni, aż larwy z grupy kontrolnej (pozornie zakażonej) oraz wszelkie przeżyłe larwy traktowane wirusem poczwarkują lub zaczną zagrzebywać się w podłożu w celu poczwarkowania. Larwy zakażone wirusem pozostaną na powierzchni pożywki, a następnie wyginą po kilku dniach. Martwe larwy czasami mumifikują się i czernieją; larwy ginące w wyniku infekcji stają się w zasadzie zbiornikami poliedrów, które ulegną całkowitemu rozpuszczeniu w przypadku mechanicznego zakłócenia w tym czasie. Następnie należy ocenić śmiertelność larw w każdej z grup badawczych.Testy biologiczne stężeń letalnych należy powtórzyć trzykrotnie lub czterokrotnie w oddzielnych próbach. W każdej dawce dla każdego wirusa lub w grupie kontrolnej należy wykorzystać 30 osobników. Do obliczenia wartości lc 50, 95% przedziałów ufności oraz odpowiednich statystyk należy użyć właściwego programu do analizy probitowej, takiego jak polo lub SAS.Niniejszy test żywienia kropelkowego może być również wykorzystany do wyznaczania wartości czasu przeżycia ST 50. W takim przypadku śmiertelność larw ocenia się co cztery do ośmiu godzin, przy częstszych obserwacjach. Jeśli wskaźnik śmiertelności jest wysoki, bioanalizy czasu przeżycia przeprowadza się z użyciem dawki wirusa lc 99, a mediany czasu przeżycia oraz 95% granice ufności oblicza się za pomocą estymatora Kaplana-Mayera przy użyciu programu s plus lub SAS.Skoro Harang zaprezentował już bioanalizę z karmieniem kroplowym, ja pokażę Państwu bioanalizę z wykorzystaniem wtyczek dietowych. W bioanalizie z wtyczkami dietowymi larwy w średnim lub późnym stadium rozwojowym są karmione wtyczką dietową traktowaną znaną dawką wirusa w celu określenia dawki śmiertelnej lub LD 50. Dzień przed przeprowadzeniem tego testu należy usunąć dietę z pojemnika, aby larwy pozostały głodowe przez noc.Ten krok zwiększy tempo konsumpcji wirusa przez larwy. W dniu następującym po inokulacji przygotuj pożywkę, dzieląc ją na małe kostki o objętości około dwóch milimetrów sześciennych. Jeśli kostki pożywki będą zbyt małe, wyschną.Jeśli kostki pożywki są zbyt duże, larwy nie będą w stanie skonsumować całej kostki w ciągu jednej nocy. Teraz należy dodać od jednego do dwóch mikrolitrów zawiesiny wielościanów do każdej kostki pożywki. Zawiesina zawiera 4% objętościowo barwnika spożywczego.Pozostaw zawiesinę do wchłonięcia przez pożywkę przez okres od pięciu do 15 minut. Pamiętaj, aby przygotować również kostkę pożywki potraktowaną pozornym wirusem jako kontrolę negatywną. Następnie przenieś jedną kostkę pożywki do każdego poczwarki czwartego stopnia w każdym kubku.Następnie umieść kubki w inkubatorze na noc w temperaturze 28°C. Następnego dnia usuń wszystkie larwy, które nie zjadły całkowicie kostki pożywki. Następnie dodaj do każdego kubka z pozostałymi larwami duży kawałek pożywki. Utrzymuj larwy w temperaturze 28°C, dodając w razie potrzeby dodatkową pożywkę, aż larwy z grupy pozorowanej zakażonej oraz przeżyjące larwy zakażone wirusem nasycą się lub rozpoczną pupowanie.W tym momencie należy odnotować liczbę martwych i przeżywających owadów. Przedstawimy dwie metody zakażania owadów wirusem baculowirusa: biopsję przez krwawienie oraz biopsję metodą placka pokarmowego. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że zwłoki larw zabitych przez baculowirusa są zazwyczaj kruche i mogą łatwo pęknąć, uwalniając wirusa.Należy zatem wysterylizować powierzchnie robocze oraz w odpowiedni sposób zutylizować skażone rękawiczki i materiały jednorazowe, aby zapobiec kontaminacji. To wszystko. Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

protocols-for-oral-infection-of-lepidopteran-larvae-with-baculovirus

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Protokoły doustnego zakażenia larw Lepidoptera bakulowirusem

W niniejszym filmie prezentujemy dwie techniki z użyciem mikroaplikatora do zakażania larw motyli z rzędu Lepidoptera baculowirusem w celu określenia efektywności owadobójczej.

Protokoły zakażania larw motyli (Lepidoptera) baculowirusami przy użyciu mikroaplikatora

Opisana tutaj metoda wykorzystuje bezpośrednią iniekcję bakterii entomopatogennych do hemocelu larw owada Manduca sexta. M. sexta jest owadem dostępnym komercyjnie i dobrze przebadanym. W związku z tym metoda ta stanowi proste podejście do analizy interakcji gospodarz-bakteria z perspektywy jednego lub obu partnerów.

Hodowla i iniekcja larw Manduca sexta w celu oceny wirulencji bakterii

Opisano doustną i wewnątrzhemokoliczną infekcję larw mchowca dużego Galleria mellonella. Owad ten może być wykorzystywany do badania czynników wirulencji bakterii entomopatogennych, a także oportunistycznych bakterii ssaków. Opisano hodowlę owadów, metody infekcji oraz przykłady analiz in vivo.

Owad Galleria mellonella jako potężny model infekcji do badania patogenezy bakteryjnej

Ten film demonstruje metodę tworzenia modelu infekcji Mycobacterium bovis u larw woskowej większej, Galleria mellonella. Bioluminescencyjny szczep Mycobacterium bovis BCG jest wstrzykiwany do hemolimfy larwy w celu wywołania infekcji, a bioluminescencja jest mierzona w określonych odstępach czasu w celu zbadania postępu infekcji.

Technika tworzenia modelu infekcji bakteryjnej u larw owadów

Śródziemnomorska muszka owocowa (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) jest światowym szkodnikiem rolnictwa. Głębsze zrozumienie jego biologii jest kluczem do kontrolowania populacji medfly, a tym samym zmniejszenia wpływu na gospodarkę. Mikroiniekcja zarodka jest podstawowym narzędziem umożliwiającym zarówno transformację linii zarodkowej, jak i odwrotne badania genetyczne u tego gatunku.

Dostarczanie kwasów nukleinowych poprzez mikroiniekcję zarodka u światowej populacji szkodników rolniczych, Ceratitis capitata

Ten protokół opisuje system ekspresji białek wywołany szokiem cieplnym (system komórkowy pDHsp/V5-His/sf9), który może być używany zarówno do ekspresji obcych białek, jak i oceny antyapoptotycznej aktywności potencjalnych obcych białek i ich skróconych aminokwasów w komórkach owadów.

Przejściowa ekspresja obcych genów w komórkach owadów (sf9) do testu funkcjonalnego białka

W tym protokole, bakulowirus jest wytwarzany przez przejściową transfekcję plazmidu bakulowirusa do komórek Sf9 i amplifikowany w kulturze zawiesinowej bez surowicy. Supernatant jest oczyszczany przez chromatografię powinowactwa heparyny i dalej zagęszczany przez ultrawirowanie. Protokół ten jest przydatny do produkcji i oczyszczania bakulowirusa do zastosowania w terapii genowej.

Produkcja i oczyszczanie bakulowirusa do zastosowania w terapii genowej

Tutaj prezentujemy protokół produkcji białek karboksyloesterazy u muchy domowej in vitro z systemem ekspresji komórek owadów za pośrednictwem bakulowirusa, a następnie funkcjonalnie charakteryzujemy ich role w metabolizowaniu permetryny, nadając w ten sposób odporność na pyretroidy poprzez przeprowadzanie testów MTT na bazie komórek i badań metabolicznych in vitro.

Charakterystyka funkcjonalna karboksylesterazy u much domowych odpornych na insektycydy, Musca domestica

Tutaj prezentujemy protokoły wykorzystania systemu ekspresji białek komórek owadów i bakulowirusa do produkcji dużych ilości białek wydzielanych przez rośliny do krystalizacji białek. Wektor ekspresyjny bakulowirusa został zmodyfikowany za pomocą GP67 lub peptydu sygnałowego hemoliny owadów w celu ekspresji wydzielania białek roślinnych w komórkach owadów.

Modyfikowanie wektorów ekspresyjnych bakulowirusa w celu wytwarzania wydzielanych białek roślinnych w komórkach owadów

System wektorów ekspresyjnych bakulowirusa (BEVS) to solidna platforma do badania ekspresji i produkcji białkowych metylotransferaz argininowych (PRMT) do wykorzystania w badaniach biochemicznych, biofizycznych i strukturalnych. Miligramowe ilości materiału mogą być produkowane dla większości PRMT i innych białek będących przedmiotem zainteresowania, wymagających eukariotycznej platformy ekspresyjnej.

Produkcja rekombinowanych białek PRMT przy użyciu systemu wektorów ekspresyjnych bakulowirusa

Badania strukturalne i biochemiczne ludzkich transporterów błonowych wymagają miligramowych ilości stabilnego, nienaruszonego i jednorodnego białka. W tym miejscu opisujemy skalowalne metody badań przesiewowych, ekspresji i oczyszczania ludzkich transporterów nośników substancji rozpuszczonych przy użyciu genów zoptymalizowanych pod kątem kodonów.

Wysokoprzepustowa ekspresja i oczyszczanie ludzkich nośników substancji rozpuszczonych do badań strukturalnych i biochemicznych

Poznaj techniki doustnego zakażenia larw Lepidoptera bakulowirusem w celu oceny skuteczności insektycydowej. Metody obejmują bioasay z kroplowym karmieniem i wtyczkami pokarmowymi.

Protokoły doustnej infekcji larw motyli z rzędu Lepidoptera wirusem z grupy Baculoviridae

Przeglądaj więcej filmów