Protokoły doustnego zakażenia larw Lepidoptera bakulowirusem

W tym filmie demonstrujemy techniki infekcji doustnych larw lepidoptera bakulowirusem, aby określić skuteczność owadobójczą.

Wirus Vao jest powszechnie stosowany jako wektor DNA stosowany w połączeniu z liniami komórkowymi owadów do ekspresji białek. Jednak fakt, że wirus ten skutecznie infekuje owady ze śmiertelnymi konsekwencjami, sprawia, że jest również skutecznym środkiem owadobójczym. Na przykład w Brazylii wirus balo typu dzikiego jest stosowany na ponad 1 milionie hektarów upraw soi rocznie w celu zwalczania gąsienicy fasoli aksamitnej w celu zwiększenia ich skuteczności owadobójczej, wirusy Balo zostały genetycznie zmodyfikowane z genami kodującymi toksyny specyficzne dla owadów, które są aktywne w HemosIL owada.

W tym filmie pokazujemy metody doustnego zakażenia larw lepidoptera wirusem bakaowym w celu analizy skuteczności owadobójczej. Cześć, pochodzę z laboratorium ślepego trybowania na Wydziale Okulistyki i Uniwersytecie Stanowym Iowa, a także jestem Wendy Sparks z laboratorium trybowania. Dzisiaj pokażemy Wam dwie procedury na zakażenie wirusem VA lter i larw.

Najpierw harran pokaże Ci, jak zakażać larwy noworodków za pomocą testu biologicznego karmienia kropelkowego. A potem pokażę ci, jak zainfekować larwy w średnim i późnym stadium za pomocą testu biologicznego krwi na diecie. Więc zacznijmy.

Testy biologiczne podawane drogą kropelkową mogą być stosowane do określenia śmiertelnej dawki abakawiru i przeżycia. Czas zakażenia larw wirusa balo. Do tego testu zwykle wykorzystuje się larwy wczesnych stadiów lub noworodków.

Zanim zaczniesz, upewnij się, że masz pod ręką kubki dietetyczne z odpowiednią dietą. Przygotuj również odpowiednie rozcieńczenia wirusa Obejmują zielony barwnik spożywczy o stężeniu 4% objętościowym. W celu określenia śmiertelnego stężenia wirusa, rozcieńczenie powinno dać zakres śmiertelności od jednego do 99%Wstępne testy biologiczne mogą być wymagane w celu określenia odpowiedniego zakresu stężeń wirusa po wirowaniu probówki, aby zapobiec osiadaniu wielościanów, wykonaj dwa koncentryczne kręgi małych kropelek roztworu wirusa na 60-milimetrowej szalce Petriego.

Dla każdego stężenia użytego wirusa należy również pamiętać o ustawieniu symulowanej infekcji kontroli negatywnej. Leczenie Następnie przenieś od 25 do 30 noworodków larw do środka koncentrycznych okręgów za pomocą sterylnego pędzla. Umieść pokrywkę na naczyniu i uszczelnij paraformem, aby zapobiec ucieczce larw

Najlepiej używać różnych pędzli do przenoszenia na każdy typ wirusa, aby zapobiec zakażeniu między zabiegami. Pozostaw naczynie w temperaturze pokojowej na 10 do 15 minut, w tym czasie larwy piją. Larwy roztworu, które się karmiły, można zidentyfikować po zielonym zabarwieniu przedniego jelita wynikającym z zielonego barwnika barwiącego żywność, który przenosi tylko te larwy, które karmiły się do plastikowych kubków o pojemności jednej uncji, które zawierają dietę, przenoszą jedną larwę na filiżankę.

Po przeniesieniu larw przykryj kubki pokrywkami i inkubuj w temperaturze 28 stopni Celsjusza 24 godziny po zakażeniu. Wyeliminuj wszystkie kubki zawierające martwe larwy. Te przedwczesne zgony prawdopodobnie wynikają z obrażeń odniesionych podczas radzenia sobie z nimi.

Podczas stosowania tego testu biologicznego w celu określenia dawki śmiertelnej, larwy powinny być sprawdzane co dwa do trzech dni, aż pozorowane zakażone larwy i wszelkie larwy leczone wirusem, które przeżyły, zostaną oczyszczone lub zaczną pożyczać się w celu przepoczwarzenia larw zakażonych wirusem, pozostaną na wierzchu pokarmu, a następnie umrą po kilku dniach. Martwe larwy czasami zamieniają się w czarne, które umierają z powodu infekcji, zasadniczo stają się workami wielościanów, które całkowicie się rozpuszczą. W przypadku zaburzeń mechanicznych w tym czasie, należy ocenić śmiertelność larw w każdym zabiegu.

Testy biologiczne stężenia śmiertelnego powinny być powtórzone trzy lub cztery razy przy różnych okazjach. Stosować 30 osób na dawkę dla każdego wirusa lub leczenia kontrolnego. Użyj odpowiedniego programu do analizy spadkowej, takiego jak polo lub SAS, aby obliczyć wartości lc 50, 95% przedziały ufności i odpowiednie statystyki.

Ten test podawania kropelkami może być również wykorzystany do określenia wartości czasu przeżycia ST 50. W tym przypadku śmiertelność larw jest oceniana co cztery do ośmiu godzin z częstszymi obserwacjami. Jeśli wskaźnik śmiertelności jest wysoki, testy biologiczne przeprowadza się przy użyciu dawki lc 99 mediany czasu przeżycia wirusa, a 95% limity ufności oblicza się za pomocą estymatora Kaplana, Mayera przy użyciu programu s plus lub SAS.

Teraz, gdy Harang pokazał ci test biologiczny karmienia kropelkowego, pokażę ci test biologiczny wtyczki dietetycznej w teście biologicznym wtyczki dietetycznej. Larwy w średnim i późnym stadium rozwojowym są karmione wtyczką dietetyczną traktowaną znaną dawką wirusa w celu określenia dawki śmiertelnej lub LD 50 w dniu poprzedzającym przeprowadzenie tego testu. Usuń dietę z kubka, aby zagłodzić larwy przez noc.

Ten krok zwiększy prędkość, z jaką larwy konsumują wirusa. Zaszczepioną kostkę dietetyczną następnego dnia przygotuj dietę, krojąc ją w drobną kostkę o około dwóch milimetrach sześciennych. Jeśli kostki dietetyczne są zbyt małe, wyschną.

Jeśli kostki dietetyczne są zbyt duże, larwy nie będą w stanie spożyć całej kostki dietetycznej w ciągu nocy. Teraz dodaj jeden do dwóch mikrolitrów zawiesiny wielościanów do każdej kostki dietetycznej. Zawiesina zawiera 4% objętościowo barwnika spożywczego.

Pozwól zawiesinie wsiąknąć w dietę przez pięć do 15 minut. Pamiętaj również, aby przygotować próbną kostkę dietetyczną traktowaną wirusem jako kontrolę negatywną. Następnie przenieś jedną kostkę dietetyczną do każdej czwartej larwy w każdym stadium rozwojowym.

Następnie następnego dnia umieść kubki w inkubatorze w inkubatorze w temperaturze 28 stopni Celsjusza, wyrzuć wszystkie larwy, które nie zjadły całkowicie kostki dietetycznej. Następnie dodaj duży kawałek diety do każdej filiżanki dla pozostałych larw. Utrzymuj larwy w temperaturze 28 stopni Celsjusza, dodając w razie potrzeby dodatkową dietę, aż pozorowane zainfekowane larwy i larwy zakażone wirusem, które przeżyły, osiągną lub zaczną się przepoczwarzać.

W tym czasie rejestruj liczbę martwych i ocalałych owadów. Pokażemy Ci tylko dwie metody zakażania owadów wirusem pleców: krwawienie, biopsję żywieniową i biopsję płytki dietetycznej. Wykonując tę procedurę, należy pamiętać, że larwy zabite przez wirusa vao są zazwyczaj delikatne i mogą łatwo pęknąć, uwalniając wirusa.

Dlatego sterylizuj powierzchnie robocze i pozbywaj się zanieczyszczonych rękawic i materiałów jednorazowego użytku w odpowiedni sposób, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.