Name: Pozyskiwanie jaj od samic Xenopus laevis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-20T20:12:00.000+00:00
Duration: 4 min 47 s
Description: Naucz się pozyskiwać i przygotowywać jaja od samic Xenopus laevis do badań biologii komórki. Protokół obejmuje indukcję składania jaj, ich zbieranie, oczyszczanie i sortowanie w celu uzyskania wysokiej jakości materiału do rekonstrukcji zdarzeń komórkowych in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pełny protokół tekstowy dla tego podejścia eksperymentalnego jest dostępny w <a href="http://mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471143031/cp/cpcb/article/cb1110/current/abstract?hd=author,Powers]">Current Protocols in Cell Biology</a>.

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

pozyskiwanie komórek jajowych od samic xenopus laevis

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

Jaja *Xenopus laevis* w stanie nienaruszonym, lizowanym i/lub frakcjonowanym są przydatne w szerokim zakresie eksperymentów. Niniejszy protokół przedstawia sposób indukowania składania jaj, ich zbierania i usuwania otoczki galaretowatej oraz sortowania jaj w celu usunięcia osobników uszkodzonych.

Jaja Xenopus laevis w stanie nienaruszonym, lizowanym i/lub frakcjonowanym są przydatne w szerokim zakresie eksperymentów. Niniejszy protokół przedstawia sposób indukowania składania jaj, ich zbierania i usuwania otoczki galaretowatej, a także sortowania jaj w celu usunięcia osobników uszkodzonych.

Pozyskiwanie komórek jajowych od samic Xenopus laevis

Jaja *Xenopus laevis* w stanie nienaruszonym, lizowanym i/lub frakcjonowanym są przydatne w szerokim zakresie eksperymentów. Niniejszy protokół przedstawia sposób indukcji składania jaj, ...

Ekstrakty z jaj Xenopus laevis są użytecznym źródłem materiału cytoplazmatycznego i organelli do in vitro rekonstrukcji procesów komórkowych, takich jak montaż jądra komórkowego oraz import białek jądrowych. Oczywiście, zanim będzie można wykorzystać ekstrakty z jaj, należy najpierw pozyskać jaja od samic żab. Cześć, nazywam się Marie Cross i jestem doktorantką w laboratorium dr Maureen Power w Katedrze Biologii Komórki na Uniwersytecie Emory w Atlancie w stanie Georgia.Dzisiaj pokażemy Państwu, jak pozyskiwać i odmiatać jaja żelowe od dojrzałych samic Opus lavis. Procedura ta obejmuje następujące etapy: przygotowanie żab do składania jaj za pomocą serym gonadotropiny, indukowanie składania jaj za pomocą ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej oraz odsortowanie uszkodzonych jaj lub oocytów. Zapraszamy do rozpoczęcia.Aby wyprodukować jaja, dojrzałe samice żab są najpierw stymulowane gonadotropiną z surowicy ciężarnej klaczy. Aby rozpocząć procedurę stymulacji, należy przygotować zbiornik zawierający 100 mM chlorku sodu do przetrzymywania żab. Po wstrzyknięciu preparatu, stymulowane żaby powinny być utrzymywane w zagęszczeniu wynoszącym około jednej żaby na litr.Optymalną produkcję jaj utrzymuje się, trzymając żaby w temperaturze 18 °C. Używając igły o rozmiarze 27 G przymocowanej do strzykawki o pojemności 1 ml, wstrzyknij żabie podskórnie do grzbietowego worka limfatycznego 0,5 ml roztworu gonadotropiny seryjnej klaczy w stężeniu 200 jednostek/ml.Przenieś żaby przygotowane do rozrodu z powrotem do zbiornika zawierającego 100 mM NaCl. Po dwóch do trzech dniach indukuj składanie jaj poprzez wstrzyknięcie żabom 0,5 ml roztworu gonadotropiny kosmicznej człowieka (hCG) o stężeniu 100 jednostek/ml. Ponownie wstrzyknij preparat podskórnie do grzbietowego worka limfatycznego.Po iniekcji umieść każdą żabę w pięciu litrach 100 mM chlorku sodu. Najlepiej umieścić każdą żabę w oddzielnym pojemniku, ponieważ jakość jaj różni się w zależności od osobnika. Około 16 do 22 godzin po iniekcji ludzkiej gonadotropiny kosmórkowej przenieś żabę do zbiornika z czystą wodą i przelej jaja do zlewki.Zaleca się obserwację żab przez jeden do dwóch dni w celu wykrycia objawów infekcji w miejscu wstrzyknięcia. Na tym etapie każde jajo jest otoczone przezroczystą galaretowatą otoczką, która zapobiega ich wzajemnemu dotykaniu; aby usunąć galaretkę z jaj, należy je jednokrotnie wypłukać w 2%L cysteinie o pH 8, a następnie inkubować w 100 bills roztworu 2%L cysteiny na żabę przez około pięć minut. W temperaturze pokojowej należy delikatnie i okresowo obracać jaja po upływie pięciu minut.Odlać roztwór cysteiny z jaj jeziornych i przemyć je trzykrotnie w 0,25-krotnym zmodyfikowanym roztworze Ringera. W celu usunięcia zanieczyszczeń, przełożyć jaja do szklanej szalki Petriego o średnicy 100 mm, pracując pod mikroskopem stereoskopowym. Usunąć uszkodzone jaja z szalki Petriego za pomocą pipety Pasteura.Dojrzałe jaja xip mają ciemno pigmentowaną połowę u góry i jasną połowę u dołu. W centrum ciemno pigmentowanej półkuli dojrzałego jaja powinna być widoczna biała kropka o rozmiarach punktowych, świadcząca o dojrzewaniu oocytu. Za dobre uznaje się jaja o równomiernej pigmentacji.Każde jajo bez tej białej plamki jest oocytem i należy je usunąć. Należy również usunąć wszystkie jaja, które są białe, powiększone lub niejednolicie pigmentowane. Jajo w szczególnie złym stanie będzie wyglądać jak biała, puszysta kulka z całkowicie zatarciem granicy między półkulami. Przesortowane jaja należy przemyć dwa do trzech razy, wlewając na nie bufor lizujący jaja, a następnie ostrożnie go zlewając, minimalizując liczbę wypłukanych jaj.Teraz można przeprowadzić lizę jaj i przygotować ekstrakty. Właśnie pokazaliśmy, jak pozyskiwać jaja od dojrzałych samic Xenopus laevis oraz jak usuwać z nich galaretkę. Koniecznie obejrzyjcie nasze dwa pozostałe filmy, w których pokazujemy, jak przygotować surowe ekstrakty z jaj oraz jak zrekonstytuować zbiórkę jądra in vitro z wykorzystaniem frakcjonowanych ekstraktów z jaj.To już wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

obtaining-eggs-from-xenopus-laevis-females

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pozyskiwanie jaj od samic Xenopus laevis

Procedura zapłodnienia oocytów Xenopus metodą transferu do gospodarza.

Zapłodnienie oocytów Xenopus metodą transferu do gospodarza

Xenopus embrionalne nabłonki stanowią idealny system modelowy do badania zachowań komórkowych, takich jak rozwój polaryzacji i zmiana kształtu podczas morfogenezy nabłonkowej. Tradycyjna histologia utrwalonych próbek jest coraz częściej uzupełniana przez konfokalne obrazowanie żywych komórek. W niniejszej pracy prezentujemy metody izolacji tkanek żaby oraz wizualizacji żywych komórek nabłonkowych i ich cytoszkieletu z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii żywych komórek.

Obrazowanie żywych komórek i analiza ilościowa embrionalnych komórek nabłonkowych u Xenopus laevis

Xenopus ekstrakt z jaj jest przydatnym systemem modelowym do badania punktu kontrolnego uszkodzeń DNA. Niniejszy protokół dotyczy przygotowania ekstraktów z jaj Xenopus oraz odczynników indukujących punkt kontrolny uszkodzeń DNA. Techniki te można zaadaptować do różnych metod wywołania uszkodzeń DNA w badaniach nad sygnałowaniem punktu kontrolnego uszkodzeń DNA.

Badanie punktu kontrolnego uszkodzeń DNA z wykorzystaniem ekstraktów z jaj Xenopus

Opisujemy zbieranie niezapłodnionych jaj Xenopus tropicalis i produkcję ekstraktu z jaj zatrzymanego przez mejozę II. Ten ekstrakt z jaj może być stosowany do oczyszczania mikrotubul i RNA związanych z mikrotubulami.

Produkcja ekstraktów jajowych Xenopus tropicalis w celu identyfikacji RNA związanych z mikrotubulami

Opisano metodę analizy degradacji białek za pomocą radioaktywnego i lucyferazy-fuzyjnego białka w ekstrakcie z jaj Xenopus oraz jej adaptację do wysokoprzepustowych badań przesiewowych dla małocząsteczkowych modulatorów degradacji białek.

Rekonstytucja degradacji β-kateniny w ekstrakcie z jaj Xenopus

Opisujemy metody manipulowania niedojrzałymi oocytami Xenopus laevis, dojrzewania in vitro oocytów do komórek jajowych oraz docytoplazmatycznego wstrzykiwania plemników. Protokół ten umożliwia degradację niektórych białek matczynych i nadekspresję genów będących przedmiotem zainteresowania podczas zapłodnienia, a zatem jest cenny dla badania ról określonych czynników we wczesnym rozwoju embrionalnym.

Manipulacja i dojrzewanie in vitro oocytów Xenopus laevis, a następnie docytoplazmatyczna iniekcja plemnika w celu zbadania rozwoju embrionalnego

Kontrola syntezy białek występuje głównie na etapie inicjacji translacji, której niedobory są związane z różnymi zaburzeniami. Aby lepiej zrozumieć ich etiologię, opisaliśmy tutaj protokół z wykorzystaniem oocytów Xenopus laevis oceniający translację transkryptu mos w obecności mutanta czynnika inicjacji translacji eIF4G1.

Xenopus laevis jako model do identyfikacji upośledzenia translacji

Mechanizmy skalowania komórkowego i wewnątrzkomórkowego pozostają nieuchwytne. Stosowanie ekstraktów z zarodków Xenopus staje się coraz bardziej powszechne w celu wyjaśnienia mechanizmów regulacji wielkości organelli. Metoda ta opisuje przygotowanie ekstraktu z zarodka i nowatorski test skalowania jądrowego, za pomocą którego można zidentyfikować mechanizmy regulacji wielkości jądra.

Bezkomórkowy test wykorzystujący ekstrakty z zarodków Xenopus laevis do badania mechanizmów regulacji wielkości jądra

Ten protokół demonstruje metodę opartą na fluorescencji do wizualizacji układu naczyniowego i ilościowego określenia jego złożoności u Xenopus tropicalis. Naczynia krwionośne można obrazować kilka minut po wstrzyknięciu barwnika fluorescencyjnego do bijącego serca zarodka po manipulacjach genetycznych i/lub farmakologicznych w celu zbadania rozwoju układu sercowo-naczyniowego in vivo.

Wizualizacja i analiza ilościowa angiogenezy embrionalnej u Xenopus tropicalis

Opisujemy metodę przygotowania i obrazowania na żywo nierozcieńczonych ekstraktów cytoplazmatycznych z jaj Xenopus laevis.

Xenopus laevis (Xenopus laevis) Przygotowanie ekstraktu z jaj i metody obrazowania na żywo do wizualizacji dynamicznej organizacji cytoplazmy

Gdy transformujący czynnik wzrostu ß białka prekursorowe rodziny są ektopowo wyrażane w zarodkach Xenopus laevis, ulegają one dimeryzacji, rozszczepianiu i są wydzielane do blastocoele, który zaczyna się w późnym stadium blastuli do wczesnego stadium gastruli. Opisano metodę zasysania produktów rozszczepienia z jamy blastocoele do analizy immunoblot.

Analiza produktów rozpadu rodziny transformujących czynników wzrostu wydzielanych do blastocoele zarodków Xenopus laevis

Naucz się pozyskiwać i przygotowywać jaja od samic Xenopus laevis do badań biologii komórki. Protokół obejmuje indukcję składania jaj, ich zbieranie, oczyszczanie i sortowanie w celu uzyskania wysokiej jakości materiału do rekonstrukcji zdarzeń komórkowych in vitro.

Pozyskiwanie komórek jajowych od samic Xenopus laevis

Przeglądaj więcej filmów