Test nieswoistej aktywności proteazy firmy Sigma – kazeina jako substrat

Proteazy rozszczepiają wiązania peptydowe w laboratorium. Często zachodzi potrzeba zmierzenia i/lub porównania aktywności proteaz. Uniwersalny test aktywności proteaz firmy Sigma może być stosowany jako znormalizowana procedura do oznaczania aktywności proteaz, co jest realizowane podczas naszych procedur kontroli jakości.

W tym teście kazeina pełni rolę substratu, który ulega trawieniu przez badaną proteazę. W procesie tym uwalniana jest tyrozyna wraz z innymi aminokwasami i fragmentami peptydowymi. Wolna tyrozyna reaguje następnie z odczynnikiem Folina-Ciocalteu (odczynnikiem Folina), tworząc niebieski chromofor, który można ilościowo określić, mierząc wartość absorbancji za pomocą spektrofotometru.

Im więcej tyrozyny zostanie uwolnionych z kazeiny, tym więcej chromoforów powstanie i tym silniejsza będzie aktywność proteazy. Wartości absorbancji wynikające z aktywności proteazy są porównywane z krzywą wzorcową, stworzoną poprzez reakcję znanych ilości tyrozyny z odczynnikiem FC w celu skorelowania zmian absorbancji. Na podstawie ilości tyrozyny w mikromolach wyznaczonej z krzywej wzorcowej można określić aktywność próbek proteazy w jednostkach, które reprezentują liczbę mikromoli ekwiwalentu tyrozyny uwalnianych z kazeiny na minutę. Witam, nazywam się Carrie Cup Vineyard i jestem naukowcem w obiekcie Sigma Aldridge DeKalb tutaj w St. Louis w stanie Missouri.

Dzisiaj zaprezentuję uniwersalną metodę testowania aktywności proteazy w Sigma Aldridge. Analizę tę stosujemy głównie w naszym dziale kontroli jakości, aby upewnić się, że proteaza posiada wystarczającą aktywność przed wysyłką bezpośrednio do Państwa laboratorium. Przed rozpoczęciem analizy musimy upewnić się, że poniższe odczynniki zostały prawidłowo przygotowane.

Bufor fosforanowy potasu 50 mM, pH 7,5. Przed użyciem roztwór umieszcza się w temperaturze 37°C. Roztwór kasianu 0,65% w/v przygotowano poprzez zmieszanie 6,5 g/ml w jednym litrze. Temperaturę roztworu stopniowo podnosi się przy łagodnym mieszaniu do 80–85°C na około 10 minut, aż do uzyskania homogenicznej dyspersji.

Bardzo ważne jest, aby nie doprowadzić do zagotowania roztworu. Następnie, w razie potrzeby, dostosowuje się pH za pomocą wodorotlenku sodu i kwasu solnego. 110 milimolarny roztwór kwasu trójchlorooctowego, przygotowany poprzez rozcieńczenie 6,1 normalnego roztworu zapasowego w stosunku 1:55 wodą oczyszczoną, 0,5 milimolarny odczynnik Folina-Ciocalteu lub odczynnik fenolowy Folina, który jest roztworem reagującym z tyrozyną w celu wywołania mierzalnej zmiany barwy.

Będzie to bezpośrednio związane z aktywnością proteaz. Roztwór węglanu sodu o stężeniu 500 mM, przygotowany przez rozpuszczenie 53 mg/mL bezwodnego węglanu sodu w wodzie oczyszczonej, oraz roztwór rozcieńczający enzym, składający się z buforu octanu sodu 10 mM z dodatkiem 5 mM wapnia, pH 7,5 w temperaturze 37 °C. Roztwór ten jest wykorzystywany do rozpuszczania stałych próbek proteaz lub rozcieńczania roztworów enzymów.

Roztwór zapasu standardu L-tyrozyny o początkowym stężeniu 1,1 milimola, będący roztworem L-tyrozyny o stężeniu 0,2 miligrama na mililitr, przygotowuje się w wodzie oczyszczonej i delikatnie podgrzewa, aż tyrozyna się rozpuści. Podobnie jak w przypadku kazeiny, nie należy doprowadzić tego roztworu do wrzenia. Należy pozwolić standardowi L-tyrozyny ostygnąć do temperatury pokojowej.

Rozwiązanie to zostanie w razie potrzeby dalej rozcieńczone w celu sporządzenia krzywej wzorcowej; przygotowano próbkę stałej proteazy o określonej aktywności, rozpuszczoną w rozcieńczalniku enzymu do stężenia od 0,1 do 0,2 jednostek na mililitr. Roztwór ten służy jako kontrola dodatnia w teście kontroli jakości oraz jako walidacja obliczeń, które zostaną wykonane w celu oznaczenia aktywności enzymu. Po przygotowaniu odczynników i doprowadzeniu ich do odpowiedniej temperatury możemy rozpocząć analizę proteazy.

Aby rozpocząć ten test, należy przygotować odpowiednie probówki o pojemności około 15 ml. Dla każdego enzymu poddanego badaniu potrzebne będą cztery probówki. Jedna probówka posłuży jako próba ślepa, a pozostałe trzy zostaną wykorzystane do oznaczenia aktywności trzech próbek.

Rozcieńczenie proteazy w trzech stopniach jest przydatne podczas wzajemnej weryfikacji końcowych obliczeń. Do każdego zestawu czterech probówek wlej po 5 mL 0,65% roztworu kazeiny i pozostaw je do wyrównania temperatury w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez około 5 minut. Następnie do trzech probówek z próbkami dodaj roztwór enzymu o różnych stężeniach, pomijając próbę ślepą. Wymieszaj zawartość poprzez delikatne wirowanie i inkubuj w temperaturze 37 °C przez dokładnie 10 minut.

Przedmiotem pomiaru i porównania między próbkami testowymi będzie aktywność proteazy oraz wynikające z niej uwalnianie tyrozyny w czasie inkubacji. Po tej 10 minutowej inkubacji do każdej probówki należy dodać pięć mililitrów odczynnika TCA. Następnie do każdej probówki, w tym do próby ślepej, dodaje się odpowiednią objętość roztworu enzymu, tak aby końcowa objętość roztworu enzymu w każdej probówce wynosiła jeden mililitr.

Jest to konieczne w celu uwzględnienia wartości absorbancji samego enzymu. Teraz inkubuj roztwory w temperaturze 30 °C przez 30 minut. W trakcie tej 30 minutowej inkubacji można przygotować rozcieńczenia wzorca tyrozyny, wykorzystując do tego sześć fiolek DR.

Może ona z łatwością pomieścić osiem mililitrów w sześciu fiolkach. Standardowe roztwory tyrozyny o stężeniu 1.1 mM dodaje się w następujących objętościach w mililitrach: 0,05, 0,1, 0,2, 0,4 oraz 0,5. Do próbki ślepej nie należy dodawać standardu tyrozyny.

W przypadku próbek testowych IPU, które wykażą niewielką zmianę barwy, mogą być wymagane wzorce o niższym stężeniu. Po dodaniu standardowego roztworu tyrozyny, do każdego ze wzorców należy dodać odpowiednią objętość oczyszczonej wody, aby doprowadzić objętość do 2 mL. Po inkubacji należy przefiltrować każdy z roztworów testowych oraz próbę ślepą.

Przy użyciu filtra strzykawkowego 0,45 µm dwa mililitry próbek testowych oraz filtratu ślepego dodaje się do czterech fiolek DR o pojemności co najmniej ośmiu mililitrów. Można zastosować ten sam typ fiolek, w których przygotowano standardy. Do wszystkich fiolek zawierających standardy oraz ślepą próbę standardową dodaje się pięć mililitrów węglanu sodu, a dla uzyskania najlepszych wyników, bezpośrednio po tym dodaje się odczynnik fallen. Następnie węglan sodu dodaje się do próbek testowych oraz ślepej próby testowej. Zauważalnie roztwory te stają się mętne po dodaniu węglanu sodu.

Następnie dodaje się odczynnik strącający, który zareaguje z wolną tyrozyną. Probówki DRAM miesza się poprzez delikatne potrząsanie kołowe, a następnie inkubuje w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Po zakończeniu inkubacji należy zauważyć, że wzorce wykazują gradację barwy korelującą z ilością dodanej tyrozyny, przy czym najwyższe stężenia tyrozyny mają najciemniejszy kolor.

Można również zauważyć wyraźną zmianę barwy w naszych próbkach testowych. Dwa mililitry tych roztworów odfiltrowuje się za pomocą filtra strzykawkowego 0,45 micron i przelewa do odpowiednich kuwet. Po zakończeniu analizy należy przejść do spektrofotometru i odczytać wartości absorbancji.

Absorbancję naszych próbek pomiaru dokonuje się za pomocą spektrofotometru przy długości fali 660 nanometrów. Przy drodze optycznej wynoszącej jeden centymetr rejestruje się wartości absorbancji dla wzorców, ślepej próby wzorcowej, poszczególnych próbek badawczych oraz ślepej próby badawczej. Po zebraniu wszystkich danych można przystąpić do wykreślenia krzywej wzorcowej.

Aby wygenerować krzywą, należy obliczyć różnicę absorbancji między wzorcem a próbą ślepą dla wzorca. Jest to wartość absorbancji przypisywana ilości tyrozyny w roztworach wzorcowych. Po przeprowadzeniu tego prostego obliczenia tworzymy krzywą wzorcową, nanosząc zmianę absorbancji naszych wzorców na oś Y, a ilość w mikromolach dla każdego z pięciu wzorców na oś X.

Po wprowadzeniu punktów danych i wygenerowaniu linii dopasowania, wyznaczamy zmianę absorbancji w próbkach badawczych, obliczając różnicę między absorbancją próbki badawczej a absorbancją próby ślepej. Korzystając z krzywej wzorcowej, odnajdujemy wartość absorbancji jednej z naszych próbek badawczych na osi Y. Następnie, prowadząc linię równolegle do osi X, przesuwamy się do punktu przecięcia z krzywą wzorcową.

Następnie, na podstawie wartości współrzędnej X odczytanej w tym punkcie, wyznaczamy ilość mikromoli tyrozyny uwolnionej podczas tej konkretnej reakcji proteolitycznej. Aby obliczyć aktywność enzymu w jednostkach na mililitr, należy wykonać następujące obliczenia: liczbę mikromoli równoważników tyrozyny, uzyskaną z krzywej wzorcowej, pomnożyć przez całkowitą objętość testu w mililitrach, która w naszym przypadku wynosi 11 ml. Następnie otrzymaną wartość należy podzielić przez trzy pozostałe wielkości.

Czas trwania analizy, którą przeprowadzaliśmy przez 10 minut, oraz objętość enzymu użytego w analizie, która była zmienna. Przyjmijmy jeden mililitr. Objętość w mililitrach użyta w detekcji kolorymetrycznej, która może się różnić w zależności od posiadanego urządzenia Qubit.

Używamy dwóch mililitrów. Mikromole tyrozyny podzielone przez czas w minutach dają nam pomiar aktywności proteazy, który określamy jako jednostki. Możemy skrócić jednostki pomiaru objętości w liczniku i mianowniku, w związku z czym otrzymujemy pomiar aktywności enzymu wyrażony w jednostkach na mililitr.

Aby określić aktywność w próbce stałej proteazy rozcieńczonej w rozcieńczalniku enzymu, dzielimy uzyskaną aktywność w jednostkach na mililitr przez stężenie substancji stałej pierwotnie użytej w tym badaniu w miligramach na mililitr, co pozwala uzyskać aktywność w jednostkach na miligram. W ten sposób zaprezentowaliśmy analizę aktywności proteazy z wykorzystaniem uniwersalnego testu aktywności proteaz firmy Sigma. Jak zauważono podczas wykonywania tej procedury, kluczowe jest, aby oba roztwory – kazeiny oraz tyrozyny – podgrzewać powoli i nie dopuścić do ich zagotowania.

Kluczowe jest również przygotowanie oddzielnych prób kontrolnych (blanków) zarówno dla standardów, jak i dla każdej z posiadanych próbek testowych. To wszystko. Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w badaniu aktywności proteaz.