Name: Test niespecyficznej aktywności proteazy Sigma - kazeina jako substrat (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-17T09:14:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Naucz się mierzyć aktywność proteaz metodą kolorymetryczną z użyciem kazeiny jako substratu. Procedura opiera się na pomiarze uwalnianej tyrozyny i zapewnia niezawodną kontrolę jakości preparatów enzymatycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Przed rozpoczęciem analizy należy upewnić się, że poniższe odczynniki zostały prawidłowo przygotowane:
<ol>
<li>Bufor fosforanowo-potasowy 50 mM, pH 7.5. Przygotować, stosując 11.4 mg/ml fosforanu potasu dwuzasadowego, trihydratu w wodzie oczyszczonej i regulując pH za pomocą 1M HCl. Roztwór ten należy ogrzać do 37°C przed użyciem.</li>
<li>0.65% (w/v) roztwór kazeiny, przygotowany poprzez wymieszanie 6.5 mg/ml kazeiny w buforze fosforanowo-potasowym 50 mM. Stopniowo zwiększać temperaturę roztworu przy delikatnym mieszaniu do 80-85 °C przez około 10 minut, aż do uzyskania homogennej dyspersji. Bardzo ważne jest, aby nie doprowadzić do zagotowania roztworu. Następnie, w razie potrzeby, należy wyregulować pH za pomocą NaOH i HCl.</li>
<li>110 mM roztwór kwasu trójchlorooctowego, przygotowany poprzez rozcieńczenie roztworu stokowego 6.1N w stosunku 1:55 wodą oczyszczoną. Kwas trójchlorooctowy jest silnym kwasem i należy z nim obchodzić się ostrożnie.</li>
<li>0.5 mM odczynnik Folina i Ciocalteu, lub odczynnik fenolowy Folina, który jest roztworem reagującym z tyrozyną w celu wywołania mierzalnej zmiany barwy bezpośrednio związanej z aktywnością proteaz. Odczynnik fenolowy Folina jest kwasem i należy z nim obchodzić się ostrożnie.</li>
<li>500 mM roztwór węglanu sodu, przygotowany z użyciem 53 mg/ml bezwodnego węglanu sodu w wodzie oczyszczonej. Roztwór rozcieńczający enzym, składający się z 10 mM buforu octanu sodu z 5mM octanu wapnia, pH 7.5, w temperaturze 37°C. Roztwór ten służy do rozpuszczania stałych próbek proteazy lub rozcieńczania roztworów enzymów.</li>
<li>1.1 mM roztwór stokowy standardu L-tyrozyny. Przygotowany przy użyciu 0.2 mg/ml L-tyrozyny w wodzie oczyszczonej i delikatnie podgrzany do czasu rozpuszczenia tyrozyny. Podobnie jak w przypadku kazeiny, nie wolno gotować tego roztworu. Pozostawić standard L-tyrozyny do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Roztwór ten zostanie następnie rozcieńczony w celu sporządzenia krzywej wzorcowej.</li>
<li>Roztwór proteazy. Bezpośrednio przed użyciem rozpuścić proteazę w roztworze rozcieńczającym enzym przygotowanym w kroku 6.</li>
</ol>
W razie potrzeby należy użyć stałej próbki proteazy o określonej aktywności, którą rozpuszcza się w rozcieńczalniku enzymów do stężenia 0,1-0,2 units/ml. Roztwór ten służy jako kontrola pozytywna w teście kontroli jakości oraz jako walidacja obliczeń, które zostaną wykonane w celu określenia aktywności enzymu.
Przygotowanie testu proteazy i krzywych wzorcowych
<ol>
<li>Aby rozpocząć ten pomiar, należy przygotować odpowiednie fiolki o pojemności około 15 ml. Dla każdego enzymu poddanego badaniu wymagane są 4 fiolki. Jedna fiolka posłuży jako próbka ślepa, a pozostałe trzy do pomiaru aktywności trzech rozcieńczeń proteazy. Wykorzystanie trzech rozcieńczeń jest pomocne przy wzajemnej weryfikacji końcowych obliczeń. <ol>
<li>Do każdego zestawu czterech fiolek należy dodać 5 ml 0,65% roztworu kazeiny. Następnie należy pozostawić je do wyrównania temperatury w kąpieli wodnej w 37°C przez około 5 minut.</li>
<li>Do trzech fiolek z próbkami badawczymi, z wyłączeniem próbki ślepej, należy dodać zmienne objętości badanego roztworu enzymu. Próbki należy wymieszać przez delikatne obracanie i inkubować w 37°C przez dokładnie dziesięć minut. Przedmiotem pomiaru i porównania między próbkami badawczymi będzie aktywność proteazy oraz wynikające z niej uwalnianie tyrozyny w tym czasie inkubacji.</li>
</ol></li>
<li>Po tej 10-minutowej inkubacji do każdej probówki należy dodać 5 ml odczynnika TCA, aby zatrzymać reakcję. Następnie do każdej probówki, w tym do próbki ślepej, należy dodać odpowiednią objętość roztworu enzymu tak, aby końcowa objętość roztworu enzymu w każdej probówce wynosiła 1 ml. Czynność ta ma na celu uwzględnienie wartości absorbancji samego enzymu oraz zapewnienie jednakowej końcowej objętości w każdej probówce. Roztwory należy inkubować w 37°C przez 30 minut. Podczas tej 30-minutowej inkubacji można przygotować rozcieńczenia wzorca tyrozyny. Należy użyć fiolek o pojemności 6 dramów (można je zastąpić probówkami polipropylenowymi), które bez trudu pomieszczą 8 ml. Do sześciu fiolek należy dodać roztwory stokowe wzorca tyrozyny 1,1 mM w następujących objętościach w ml: 0,05, 0,10, 0,20, 0,40, 0,50. Do próbki ślepej nie dodaje się wzorca tyrozyny. W przypadku nieczystych próbek badawczych, które wywołają niewielką zmianę barwy, mogą być wymagane niższe stężenia wzorców. Po dodaniu roztworu wzorca tyrozyny do każdego z nich należy dodać odpowiednią objętość wody oczyszczonej, aby doprowadzić objętość do 2 ml.</li>
<li>Po 30-minutowej inkubacji każdy z roztworów badawczych oraz próbkę ślepą należy przefiltrować za pomocą strzykawkowego filtra z polietersulfonu 0,45 µm. Filtracja jest niezbędna do usunięcia z próbek wszelkich substancji nierozpuszczalnych. <ol>
<li>Przesączone 2 ml próbek badawczych i filtrat próbki ślepej należy przenieść do 4 fiolek o pojemności co najmniej 8 ml. Można użyć tego samego rodzaju fiolek, w których przygotowano wzorce.</li>
<li>Do wszystkich fiolek zawierających wzorce i ślepą próbkę wzorca należy dodać 5 ml węglanu sodu. Dla uzyskania najlepszych wyników należy bezzwłocznie dodać 1 ml odczynnika Folina.</li>
<li>Węglan sodu dodaje się w celu zneutralizowania spadku pH spowodowanego dodaniem odczynnika Folina.</li>
<li>Do próbek badawczych i ślepej próbki badawczej należy dodać węglan sodu. Roztwory te stają się mętne po dodaniu węglanu sodu. Następnie należy dodać odczynnik Folina, który zareaguje głównie z wolną tyrozyną.</li>
<li>Fiolki należy wymieszać przez delikatne obracanie i inkubować w 37°C przez 30 minut.</li>
</ol>Po tej inkubacji powinno być zauważalne, że wzorce wykazują gradację barwy korelującą z ilością dodanej tyrozyny; najwyższe stężenia tyrozyny będą miały najciemniejszy kolor. W próbkach badawczych również można zauważyć wyraźną zmianę barwy. 2 ml tych roztworów należy przefiltrować za pomocą strzykawkowego filtra z polietersulfonu 0,45 µm do odpowiednich kuwet. Po wykonaniu pomiaru &nbsp;można przejść do spektrofotometru w celu zarejestrowania wartości absorbancji.</li>
</ol>
Pomiar absorbancji i obliczanie aktywności enzymu
<ol>
<li>Absorbancję próbek pomiarza się za pomocą spektrofotometru przy długości fali 660nm. Droga optyczna jest ustawiona na 1cm. Należy zapisać wartości absorbancji dla standardów, ślepej próby standardu, poszczególnych próbek badawczych oraz ślepej próby badawczej. Po zebraniu wszystkich danych można sporządzić krzywą wzorcową. W celu wygenerowania krzywej należy obliczyć różnicę absorbancji między standardem a ślepą próbą standardu. Jest to wartość absorbancji przypisywana ilości tyrozyny w roztworach standardowych. Po tym prostym obliczeniu należy stworzyć krzywą wzorcową za pomocą programu graficznego, nanosząc zmianę absorbancji standardów na oś Y, a ilość w mikromolach dla każdego z 5 standardów na oś X. 
<table style="width: 416px; height: 118px;" border="0">
<tbody>
<tr>
<td style="text-align:center">Objętość standardu tyrozyny> </td><td style="text-align:center">uMole tyrozyny> </td>
</tr>
<tr>
<td style="text-align:center">0,05</td>
<td style="text-align:center">0,055</td>
</tr>
<tr>
<td style="text-align:center">0,10</td>
<td style="text-align:center">0,111</td>
</tr>
<tr>
<td style="text-align:center">0,20</td>
<td style="text-align:center">0,221</td>
</tr>
<tr>
<td style="text-align:center">0,40</td>
<td style="text-align:center">0,442</td>
</tr>
<tr>
<td style="text-align:center">0,50</td>
<td style="text-align:center">0,553</td>
</tr>
</tbody>
</table>
</li>
<li>Po wprowadzeniu punktów danych należy wyznaczyć linię trendu i odpowiadające jej równanie nachylenia. Zmianę absorbancji w próbkach badawczych wyznacza się obliczając różnicę między absorbancją próbki badawczej a absorbancją ślepej próby badawczej. Podstawienie wartości absorbancji jednej z próbek badawczych do równania nachylenia i rozwiązanie go pozwoli uzyskać liczbę mikromoli tyrozyny uwolnionej podczas tej konkretnej reakcji proteolitycznej. Aby obliczyć aktywność enzymu w jednostkach/ml, należy wykonać następujące obliczenie: (uwolnione ekwiwalenty umole tyrozyny) x (11) Jednostki/ml enzymu = __________________________________________ (1) x (10) x (2) 11= Całkowita objętość testu (w mililitrach) 10= Czas testu (w minutach) zgodnie z definicją jednostki 1= Objętość enzymu (w mililitrach) użytego w teście 2= Objętość (w mililitrach) użyta w oznaczaniu kolorymetrycznym Należy wziąć liczbę uwolnionych ekwiwalentów mikromoli tyrozyny uzyskaną z równania nachylenia i pomnożyć ją przez całkowitą objętość testu w ml, która w naszym przypadku wynosi 11ml. Wartość tę należy podzielić przez trzy inne wielkości: czas testu, który trwał 10 minut, objętość enzymu użytego w teście, która była zmienna (przyjmijmy 1ml), oraz objętość w mililitrach użytą w detekcji kolorymetrycznej, która może się różnić w zależności od użytej kuwety. My użyliśmy 2ml.</li>
<li>Iloraz mikromoli tyrozyny i czasu w minutach daje pomiar aktywności proteazy nazywany „jednostkami”. Możemy skrócić jednostki pomiaru objętości w liczniku i mianowniku, otrzymując pomiar aktywności enzymu w jednostkach/ml. Aby określić aktywność w stałej próbce proteazy rozcieńczonej w rozcieńczalniku enzymu, dzielimy aktywność w jednostkach/ml przez stężenie substancji stałej pierwotnie użytej w tym teście w mg/ml, co daje nam aktywność w jednostkach/mg. Jednostki/ml enzymu Jednostki/mg substancji stałej = _____________________ mg substancji stałej/ ml enzymu </li>
</ol>

<ol><li>Anson, M. L. J. Gen. Physiol. 22, 79-89 (1938).</li>
<li>Folin, O., Ciocalteau, V. J. Biol. Chem. 73, 627- (1929).</li>
</ol>

Właśnie zaprezentowaliśmy sposób analizy aktywności proteazy z wykorzystaniem uniwersalnego testu aktywności proteazy firmy Sigma. Ponadto test ten jest przydatny do upewnienia się, że nasze proteazy mają precyzyjnie określoną aktywność przed ich dostarczeniem do Państwa eksperymentów. Jak Państwo zauważyli, podczas wykonywania tej procedury niezwykle ważne jest, aby powoli podgrzewać zarówno roztwory kazeiny, jak i tyrozyny i nie dopuścić do ich zagotowania. Krytyczne jest również przygotowanie oddzielnych prób ślepych zarówno dla wzorców, jak i dla każdej z badanych próbek.

<table><tbody><tr><td>Proteaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4630</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu, dwuzasadowy, trihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>Kazeina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7078</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trójchlorooctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0699</td><td></td></tr><tr><td>Folin &amp;odczynnik fenolowy Ciocalteu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9252</td><td></td></tr><tr><td>Węglan sodu, bezwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu, trihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td>Octan wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1000</td><td></td></tr><tr><td>L-tyrozyna, wolna zasada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Protease Profiler</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PP0500</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do fluorescencyjnej detekcji proteaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PF0100</td><td></td></tr></tbody></table>

test nieswoistej aktywności proteazy firmy sigma – kazeina jako substrat

Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

Proteazy rozrywają wiązania peptydowe. W laboratorium często konieczne jest pomiar i/lub porównanie aktywności proteaz. Test niespecyficznej aktywności proteazy firmy Sigma może być wykorzystany jako zstandaryzowana procedura do oznaczania aktywności proteaz, co stosujemy w naszych procedurach kontroli jakości. W tym teście kazeina pełni rolę substratu. Podczas gdy badana proteaza trawi kazeinę, uwalniany jest aminokwas tyrozyna wraz z innymi aminokwasami i fragmentami peptydowymi. Odczynnik Folina i Ciocalteusa, czyli odczynnik Folina, reaguje przede wszystkim z wolną tyrozyną, tworząc niebieski chromofor, który jest mierzalny i określany jako wartość absorbancji w spektrofotometrze. Im więcej tyrozyny zostanie uwolnionych z kazeiny, tym więcej chromoforów powstaje, co świadczy o silniejszej aktywności proteazy. Wartości absorbancji wynikające z aktywności proteazy są porównywane z krzywą wzorcową, którą tworzy się poprzez reakcję znanych ilości tyrozyny z odczynnikiem F-C, aby skorelować zmiany absorbancji z ilością tyrozyny w mikromolach. Na podstawie krzywej wzorcowej można określić aktywność próbek proteazy w Jednostkach, które stanowią ilość ekwiwalentów tyrozyny w mikromolach uwalnianych z kazeiny na minutę.
Aby wyświetlić ten artykuł w języku chińskim, <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=910">kliknij tutaj</a>

Proteazy rozrywają wiązania peptydowe. W laboratorium często zachodzi konieczność pomiaru i/lub porównania aktywności proteaz. Test nieswoistej aktywności proteaz firmy Sigma może być stosowany jako zstandaryzowana procedura do oznaczania aktywności proteaz.

Test nieswoistej aktywności proteazy firmy Sigma – kazeina jako substrat

Proteazy rozrywają wiązania peptydowe. W warunkach laboratoryjnych często zachodzi potrzeba pomiaru i/lub porównania aktywności proteaz. Nieswoista proteaza firmy Sigma...

Proteazy rozszczepiają wiązania peptydowe w laboratorium. Często zachodzi potrzeba zmierzenia i/lub porównania aktywności proteaz. Uniwersalny test aktywności proteaz firmy Sigma może być stosowany jako znormalizowana procedura do oznaczania aktywności proteaz, co jest realizowane podczas naszych procedur kontroli jakości.W tym teście kazeina pełni rolę substratu, który ulega trawieniu przez badaną proteazę. W procesie tym uwalniana jest tyrozyna wraz z innymi aminokwasami i fragmentami peptydowymi. Wolna tyrozyna reaguje następnie z odczynnikiem Folina-Ciocalteu (odczynnikiem Folina), tworząc niebieski chromofor, który można ilościowo określić, mierząc wartość absorbancji za pomocą spektrofotometru.Im więcej tyrozyny zostanie uwolnionych z kazeiny, tym więcej chromoforów powstanie i tym silniejsza będzie aktywność proteazy. Wartości absorbancji wynikające z aktywności proteazy są porównywane z krzywą wzorcową, stworzoną poprzez reakcję znanych ilości tyrozyny z odczynnikiem FC w celu skorelowania zmian absorbancji. Na podstawie ilości tyrozyny w mikromolach wyznaczonej z krzywej wzorcowej można określić aktywność próbek proteazy w jednostkach, które reprezentują liczbę mikromoli ekwiwalentu tyrozyny uwalnianych z kazeiny na minutę. Witam, nazywam się Carrie Cup Vineyard i jestem naukowcem w obiekcie Sigma Aldridge DeKalb tutaj w St. Louis w stanie Missouri.Dzisiaj zaprezentuję uniwersalną metodę testowania aktywności proteazy w Sigma Aldridge. Analizę tę stosujemy głównie w naszym dziale kontroli jakości, aby upewnić się, że proteaza posiada wystarczającą aktywność przed wysyłką bezpośrednio do Państwa laboratorium. Przed rozpoczęciem analizy musimy upewnić się, że poniższe odczynniki zostały prawidłowo przygotowane.Bufor fosforanowy potasu 50 mM, pH 7,5. Przed użyciem roztwór umieszcza się w temperaturze 37°C. Roztwór kasianu 0,65% w/v przygotowano poprzez zmieszanie 6,5 g/ml w jednym litrze. Temperaturę roztworu stopniowo podnosi się przy łagodnym mieszaniu do 80–85°C na około 10 minut, aż do uzyskania homogenicznej dyspersji.Bardzo ważne jest, aby nie doprowadzić do zagotowania roztworu. Następnie, w razie potrzeby, dostosowuje się pH za pomocą wodorotlenku sodu i kwasu solnego. 110 milimolarny roztwór kwasu trójchlorooctowego, przygotowany poprzez rozcieńczenie 6,1 normalnego roztworu zapasowego w stosunku 1:55 wodą oczyszczoną, 0,5 milimolarny odczynnik Folina-Ciocalteu lub odczynnik fenolowy Folina, który jest roztworem reagującym z tyrozyną w celu wywołania mierzalnej zmiany barwy.Będzie to bezpośrednio związane z aktywnością proteaz. Roztwór węglanu sodu o stężeniu 500 mM, przygotowany przez rozpuszczenie 53 mg/mL bezwodnego węglanu sodu w wodzie oczyszczonej, oraz roztwór rozcieńczający enzym, składający się z buforu octanu sodu 10 mM z dodatkiem 5 mM wapnia, pH 7,5 w temperaturze 37 °C. Roztwór ten jest wykorzystywany do rozpuszczania stałych próbek proteaz lub rozcieńczania roztworów enzymów.Roztwór zapasu standardu L-tyrozyny o początkowym stężeniu 1,1 milimola, będący roztworem L-tyrozyny o stężeniu 0,2 miligrama na mililitr, przygotowuje się w wodzie oczyszczonej i delikatnie podgrzewa, aż tyrozyna się rozpuści. Podobnie jak w przypadku kazeiny, nie należy doprowadzić tego roztworu do wrzenia. Należy pozwolić standardowi L-tyrozyny ostygnąć do temperatury pokojowej.Rozwiązanie to zostanie w razie potrzeby dalej rozcieńczone w celu sporządzenia krzywej wzorcowej; przygotowano próbkę stałej proteazy o określonej aktywności, rozpuszczoną w rozcieńczalniku enzymu do stężenia od 0,1 do 0,2 jednostek na mililitr. Roztwór ten służy jako kontrola dodatnia w teście kontroli jakości oraz jako walidacja obliczeń, które zostaną wykonane w celu oznaczenia aktywności enzymu. Po przygotowaniu odczynników i doprowadzeniu ich do odpowiedniej temperatury możemy rozpocząć analizę proteazy.Aby rozpocząć ten test, należy przygotować odpowiednie probówki o pojemności około 15 ml. Dla każdego enzymu poddanego badaniu potrzebne będą cztery probówki. Jedna probówka posłuży jako próba ślepa, a pozostałe trzy zostaną wykorzystane do oznaczenia aktywności trzech próbek.Rozcieńczenie proteazy w trzech stopniach jest przydatne podczas wzajemnej weryfikacji końcowych obliczeń. Do każdego zestawu czterech probówek wlej po 5 mL 0,65% roztworu kazeiny i pozostaw je do wyrównania temperatury w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez około 5 minut. Następnie do trzech probówek z próbkami dodaj roztwór enzymu o różnych stężeniach, pomijając próbę ślepą. Wymieszaj zawartość poprzez delikatne wirowanie i inkubuj w temperaturze 37 °C przez dokładnie 10 minut.Przedmiotem pomiaru i porównania między próbkami testowymi będzie aktywność proteazy oraz wynikające z niej uwalnianie tyrozyny w czasie inkubacji. Po tej 10 minutowej inkubacji do każdej probówki należy dodać pięć mililitrów odczynnika TCA. Następnie do każdej probówki, w tym do próby ślepej, dodaje się odpowiednią objętość roztworu enzymu, tak aby końcowa objętość roztworu enzymu w każdej probówce wynosiła jeden mililitr.Jest to konieczne w celu uwzględnienia wartości absorbancji samego enzymu. Teraz inkubuj roztwory w temperaturze 30 °C przez 30 minut. W trakcie tej 30 minutowej inkubacji można przygotować rozcieńczenia wzorca tyrozyny, wykorzystując do tego sześć fiolek DR.Może ona z łatwością pomieścić osiem mililitrów w sześciu fiolkach. Standardowe roztwory tyrozyny o stężeniu 1.1 mM dodaje się w następujących objętościach w mililitrach: 0,05, 0,1, 0,2, 0,4 oraz 0,5. Do próbki ślepej nie należy dodawać standardu tyrozyny.W przypadku próbek testowych IPU, które wykażą niewielką zmianę barwy, mogą być wymagane wzorce o niższym stężeniu. Po dodaniu standardowego roztworu tyrozyny, do każdego ze wzorców należy dodać odpowiednią objętość oczyszczonej wody, aby doprowadzić objętość do 2 mL. Po inkubacji należy przefiltrować każdy z roztworów testowych oraz próbę ślepą.Przy użyciu filtra strzykawkowego 0,45 µm dwa mililitry próbek testowych oraz filtratu ślepego dodaje się do czterech fiolek DR o pojemności co najmniej ośmiu mililitrów. Można zastosować ten sam typ fiolek, w których przygotowano standardy. Do wszystkich fiolek zawierających standardy oraz ślepą próbę standardową dodaje się pięć mililitrów węglanu sodu, a dla uzyskania najlepszych wyników, bezpośrednio po tym dodaje się odczynnik fallen. Następnie węglan sodu dodaje się do próbek testowych oraz ślepej próby testowej. Zauważalnie roztwory te stają się mętne po dodaniu węglanu sodu.Następnie dodaje się odczynnik strącający, który zareaguje z wolną tyrozyną. Probówki DRAM miesza się poprzez delikatne potrząsanie kołowe, a następnie inkubuje w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Po zakończeniu inkubacji należy zauważyć, że wzorce wykazują gradację barwy korelującą z ilością dodanej tyrozyny, przy czym najwyższe stężenia tyrozyny mają najciemniejszy kolor.Można również zauważyć wyraźną zmianę barwy w naszych próbkach testowych. Dwa mililitry tych roztworów odfiltrowuje się za pomocą filtra strzykawkowego 0,45 micron i przelewa do odpowiednich kuwet. Po zakończeniu analizy należy przejść do spektrofotometru i odczytać wartości absorbancji.Absorbancję naszych próbek pomiaru dokonuje się za pomocą spektrofotometru przy długości fali 660 nanometrów. Przy drodze optycznej wynoszącej jeden centymetr rejestruje się wartości absorbancji dla wzorców, ślepej próby wzorcowej, poszczególnych próbek badawczych oraz ślepej próby badawczej. Po zebraniu wszystkich danych można przystąpić do wykreślenia krzywej wzorcowej.Aby wygenerować krzywą, należy obliczyć różnicę absorbancji między wzorcem a próbą ślepą dla wzorca. Jest to wartość absorbancji przypisywana ilości tyrozyny w roztworach wzorcowych. Po przeprowadzeniu tego prostego obliczenia tworzymy krzywą wzorcową, nanosząc zmianę absorbancji naszych wzorców na oś Y, a ilość w mikromolach dla każdego z pięciu wzorców na oś X.Po wprowadzeniu punktów danych i wygenerowaniu linii dopasowania, wyznaczamy zmianę absorbancji w próbkach badawczych, obliczając różnicę między absorbancją próbki badawczej a absorbancją próby ślepej. Korzystając z krzywej wzorcowej, odnajdujemy wartość absorbancji jednej z naszych próbek badawczych na osi Y. Następnie, prowadząc linię równolegle do osi X, przesuwamy się do punktu przecięcia z krzywą wzorcową.Następnie, na podstawie wartości współrzędnej X odczytanej w tym punkcie, wyznaczamy ilość mikromoli tyrozyny uwolnionej podczas tej konkretnej reakcji proteolitycznej. Aby obliczyć aktywność enzymu w jednostkach na mililitr, należy wykonać następujące obliczenia: liczbę mikromoli równoważników tyrozyny, uzyskaną z krzywej wzorcowej, pomnożyć przez całkowitą objętość testu w mililitrach, która w naszym przypadku wynosi 11 ml. Następnie otrzymaną wartość należy podzielić przez trzy pozostałe wielkości.Czas trwania analizy, którą przeprowadzaliśmy przez 10 minut, oraz objętość enzymu użytego w analizie, która była zmienna. Przyjmijmy jeden mililitr. Objętość w mililitrach użyta w detekcji kolorymetrycznej, która może się różnić w zależności od posiadanego urządzenia Qubit.Używamy dwóch mililitrów. Mikromole tyrozyny podzielone przez czas w minutach dają nam pomiar aktywności proteazy, który określamy jako jednostki. Możemy skrócić jednostki pomiaru objętości w liczniku i mianowniku, w związku z czym otrzymujemy pomiar aktywności enzymu wyrażony w jednostkach na mililitr.Aby określić aktywność w próbce stałej proteazy rozcieńczonej w rozcieńczalniku enzymu, dzielimy uzyskaną aktywność w jednostkach na mililitr przez stężenie substancji stałej pierwotnie użytej w tym badaniu w miligramach na mililitr, co pozwala uzyskać aktywność w jednostkach na miligram. W ten sposób zaprezentowaliśmy analizę aktywności proteazy z wykorzystaniem uniwersalnego testu aktywności proteaz firmy Sigma. Jak zauważono podczas wykonywania tej procedury, kluczowe jest, aby oba roztwory – kazeiny oraz tyrozyny – podgrzewać powoli i nie dopuścić do ich zagotowania.Kluczowe jest również przygotowanie oddzielnych prób kontrolnych (blanków) zarówno dla standardów, jak i dla każdej z posiadanych próbek testowych. To wszystko. Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w badaniu aktywności proteaz.

sigma-s-non-specific-protease-activity-assay-casein-as-a-substrate

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Test niespecyficznej aktywności proteazy Sigma - kazeina jako substrat

Zestaw do fluorescencyjnego wykrywania proteaz został opracowany do pomiaru aktywności proteaz metodą fluorometrii. Nadaje się on również do wykrywania śladowych ilości zanieczyszczeń proteazami. Metoda opiera się na proteolitycznej hydrolizie opatentowanej formulacji substratu kazeinowego znakowanego FITC.

Zastosowanie zestawu do fluorescencyjnego wykrywania proteaz w celu oznaczenia aktywności proteazy

Stosujemy analizę oddziaływań białkowych bez użycia znaczników z wykorzystaniem systemu Biacore X100 do analizy struktura-funkcja wiązania kilku mutantów cystatyny B z papainą poprzez charakterystykę kinetyczną. Analiza stężenia bez kalibracji (CFCA) pozwala zmierzyć stężenie białka zachowującego aktywność wiązania bez konieczności stosowania krzywej wzorcowej. Wykazujemy, że potwierdzenie stężeń za pomocą CFCA zwiększa wiarygodność analizy kinetycznej oraz że stałe kinetyczne można rzetelnie...

Znaczenie prawidłowego stężenia białka dla wyznaczania kinetyki i powinowactwa w analizie zależności struktura-funkcja

Ten film demonstruje test biosensoryczny konduktometryczny do badania interakcji przeciwciała z docelowym antygenem unieruchomionym na chipie przetwornika. Bioczujnik został zaprojektowany tak, aby zawierał dwufunkcyjne białko chimeryczne – enzym β-laktamazy z funkcjonalnym miejscem katalitycznym połączonym z nanolitem w celu związania się z unieruchomionym antygenem docelowym. Po związaniu katalityczna hydroliza substratu antybiotykowego przez enzym β-laktamazę generuje sygnał elektryczny –...

Test biosensoryczny konduktometryczny na bazie β-laktamazy do interakcji białko-białko

Ten film demonstruje test do badania proteolitycznego aktywności proteaz za pomocą peptydów fluorogennych. Proteaza rozpoznaje miejsce jego rozszczepienia na peptydzie, rozszczepiając go i oddzielając wygaszacz od fluoroforu, umożliwiając jego emisję fluorescencyjną. Sygnał fluorescencyjny jest wykrywany i analizowany w celu sprawdzenia wydajności rozszczepienia różnych wariantów peptydów.

Test rozszczepienia peptydów fluorogenicznych w celu zbadania aktywności proteolitycznej proteaz

Ten film pokazuje, jak mierzyć aktywność proteasomu w różnych subkomórkowych przedziałach bocznego ciała migdałowatego z mózgów szczurów kondycjonowanych strachem i kontrolnych za pomocą testu peptydów fluorogennych. Proteasom rozszczepia substrat peptydu fluorogenicznego, uwalniając cząsteczki fluorescencyjne, które są oznaczane ilościowo za pomocą czytnika płytek w celu oceny aktywności proteasomu we frakcjach białek jądrowych i synaptycznych. Zwiększona aktywność jądrowa sugeruje zmiany w...

Pomiar aktywności proteasomu w różnych subkomórkowych przedziałach mózgu szczura

Tutaj prezentujemy protokoły do szybkiego badania i charakteryzowania enzymów pod kątem aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Test dyfuzji mikroszkiełkowej i test uwalniania barwnika wykorzystują docelowe substraty bakteryjne do jakościowej i ilościowej oceny aktywności enzymatycznej.

Testy jakościowe i ilościowe do wykrywania i charakterystyki białkowych środków przeciwdrobnoustrojowych

Tutaj prezentujemy protokół do określania specyficzności proteazy w surowych ekstraktach tkanek myszy za pomocą spektrometrii MALDI-TOF.

Oznaczanie swoistości proteazy w ekstraktach tkanek myszy za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF: manipulowanie PH w celu wywołania zmian swoistości

Prezentujemy test rozszczepienia peptydów fluorogennych, który pozwala na szybkie badanie przesiewowe aktywności proteolitycznej proteaz na peptydach reprezentujących miejsce cięcia peptydów fuzji wirusów. Metoda ta może być również stosowana na dowolnym innym motywie aminokwasowym w sekwencji białka w celu zbadania aktywności proteazy.

Test rozszczepienia peptydów fluorogenicznych do badań przesiewowych pod kątem aktywności proteolitycznej: zastosowania do aktywacji białka kolca koronawirusa

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół dla zmodyfikowanej techniki zymograficznej, w której peptydy fluorescencyjne są używane jako degradowalny substrat zamiast natywnych białek. Elektroforeza próbek biologicznych w fluorescencyjnych zymogramach peptydowych umożliwia wykrycie szerszego zakresu proteaz niż dotychczasowe techniki zymograficzne.

Wykrywanie aktywności proteazy za pomocą fluorescencyjnej symografii peptydowej

W tym manuskrypcie ustaliliśmy metodę wysokoprzepustową do ilościowego oznaczania aktywności fosfatazy alkalicznej w hodowli biofilmu S. aureus z 96-dołkowej płytki do hodowli...

Analiza kolorymetryczna aktywności fosfatazy alkalicznej w biofilmie S. aureus

Ta metoda opisuje test sedymentacji in vitro oparty na lektynie, który pozwala określić ilościowo powinowactwo wiązania fosfatazy glukanowej i amylopektyny. Ten test kosedymentacji jest niezawodny w pomiarze wiązania substratu fosfatazy glukanowej i może być stosowany do różnych rozpuszczonych substratów glukanu.

Test sedymentacyjny na bazie konkanawaliny A do pomiaru wiązania substratów fosfataz glukanu

Naucz się mierzyć aktywność proteaz metodą kolorymetryczną z użyciem kazeiny jako substratu. Procedura opiera się na pomiarze uwalnianej tyrozyny i zapewnia niezawodną kontrolę jakości preparatów enzymatycznych.

Test nieswoistej aktywności proteazy firmy Sigma – kazeina jako substrat

Przeglądaj więcej filmów