Montaż jądra in vitro z wykorzystaniem frakcjonowanych ekstraktów z jaj Xenopus

Ekstrakty z jaj *Xenopus laevis* są użyteczne jako materiał cytoplazmatyczny i organellowy do rekonstrukcji in vitro zdarzeń komórkowych, takich jak montaż jądra oraz import białek jądrowych. Po dodaniu chromatyny DNA plemników do surowych lub frakcjonowanych ekstraktów z jaj XUS, pęcherzyki błonowe obecne w ekstrakcie wiążą się z powierzchnią chromatyny, łączą i włączają komponenty porów jądrowych, tworząc w pełni funkcjonalne syntetyczne jądra. Charakterystyka molekularnych podstaw tych procesów jest następnie możliwa poprzez immunodeplecję ekstraktów oraz edycję białek.

Witajcie, nazywam się Marie Cross i jestem doktorantką w laboratorium dr Maureen Power w Departamencie Biologii Komórki na Uniwersytecie Emory w Atlancie w stanie Georgia. Dzisiaj pokażemy Państwu, jak formować jądra komórkowe in vitro, wykorzystując frakcjonowane ekstrakty z jaj Xenopus. Procedura ta obejmuje następujące etapy: przeprowadzenie reakcji montażu jądra oraz ocenę formowania się jąder.

Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć montaż jąder, pobierz alikwot frakcjonowanego cytosolu i dodaj fosfokreatynę z roztworu stokowego 0,2 M do stężenia końcowego 20 mM. Następnie dodaj kinazę kreatynową z roztworu stokowego 5 mg/mL do stężenia końcowego 50 µg/mL.

Na koniec dodaj 20 µM ATP, korzystając ze stoku 0,2 M. Następnie dodaj membrany lekkie do cytozolu w rozcieńczeniu 1:10. Przybliża to ilość błony obecną w oryginalnym ekstrakcie surowym.

Wymieszaj wszystkie składniki, pipetując ciecz w górę i w dół, aby rozprzestrzenić błony w ekstrakcie. Należy to zrobić przed dodaniem chromatyny plemnikowej. Następnie dodaj chromatynę plemnikową do frakcjonowanego ekstraktu w pożądanej stężeniu i natychmiast wymieszaj ekstrakt z plemnikami, delikatnie pipetując w górę i w dół przy użyciu końcówki z odciętym końcem.

Po dodaniu chromatyny plemników do ekstraktu natychmiast zaczyna ona ulegać dekondensacji, kondensować i stawać się podatną na ścinanie. Zazwyczaj reakcje te przeprowadza się w probówkach do wirówek o pojemności 500 µL, przy całkowitej objętości poniżej 100 µL. Ekstrakty z oocytów umożliwiają utworzenie od 8 000 do 9 000.

Liczba jąder na mikrolitr; inkubuj mieszaninę od jednej do dwóch godzin w temperaturze pokojowej, aby umożliwić formowanie się jąder. Jądra są wizualizowane przy użyciu barwienia. Po około 30 minutach nowo powstałe jądra będą małe i owalne.

DNA jest wciąż dość skondensowany, a jądro powinno wydawać się jednolicie jasnoniebieskie podczas wirowania haczyka, gdy obserwuje się je w kanale UV w miarę kondensacji DNA. Ponadto barwienie na niebiesko stanie się mniej homogeniczne, a z czasem zaczną pojawiać się czarne przerwy. Formowanie się błony jądrowej można zwizualizować, dodając do utrwalacza jeden mikrogram na samca 3,3-diaminocykloheksanokarbonylo-diimidu lub DHCC.

DHCC jest fluorescencyjnym barwnikiem lipofilnym, który jest wizualizowany w kanale fluoresceiny. We wczesnych etapach składania jąder komórkowych pęcherzyki błonowe wiążą się z powierzchnią chromatyny i zaczynają fuzować w obrębie plam. Skutkuje to nierównym i nieciągłym wyglądem formującej się błony.

Po utworzeniu się błony, wygładza się ona na powierzchni jądra i pojawia się jako równa, nieprzerwana obwódka wokół DNA. W otaczającym cytosolu wystąpi znaczna ilość fluorescencji tła z powodu pęcherzyków błonowych, które nie zostały wbudowane do jąder. Przedstawiliśmy właśnie in vitro rekonstrukcję jądra z wykorzystaniem rozpuszczalnych i lekkich frakcji błonowych z ekstraktu z jajgo Xenopus.

Należy pamiętać, że ekstrakt surowy można wykorzystać do montażu jąder, jednak nie po zamrożeniu i rozmrożeniu. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.