Wykorzystanie pęsety laserowej do manipulowania izolowanymi neuronami in vitro

Ashkin był pierwszą osobą, która wykazała, że pęsety laserowe lub pułapki optyczne stanowią potężne narzędzie do manipulowania mikroskopijnymi, zminiaturyzowanymi obiektami żywymi. W tym filmie pokażemy, w jaki sposób zastosowaliśmy tę technologię do wychwytywania i przemieszczania neuronów. Oto stanowisko pracy z pęsetą optyczną.

Zielone strzałki pokazują drogę wiązki lasera przechodzącej przez optykę mikroskopu. Gdy wiązka lasera skupiona przez obiektyw mikroskopu ulega refrakcji w komórce, siła zmieniająca kierunek promienia świetlnego działa na komórkę, przesuwając ją w stronę centrum ogniska.

Generuje to siłę rzędu pikoniutonów, wystarczającą do przemieszczania komórki w medium. W tym filmie omówimy wykonanie szalek, przygotowanie komórek siatkówki, wysiewanie komórek na hodowlane szalki, manipulację za pomocą pęsety laserowej oraz obserwację wzrostu komórek. Ponieważ komórki przylegają do szkła, musieliśmy stworzyć obszar odpychający komórki, w którym można je łatwo chwytać za pomocą pęsety.

Połowę płytki pokryto poly hema, polimerem odpychającym komórki. Druga połowa została pokryta cell one, podłożem wspierającym wzrost naszych komórek. W pierwszej kolejności identyfikuje się komórkę po stronie adhezyjnej płytki.

Następnie kolejna komórka zostaje uwięziona po stronie polimerowej i przetransportowana na stronę adhezyjną, gdzie obie komórki zostają sparowane. Do przygotowania naczyń używamy sterylizowanych, oczyszczonych sprężonym powietrzem szalek hodowlanych Polystar o średnicy 35 mm. Najpierw w dnie wycinamy otwór o średnicy 1 cm za pomocą małej tokarki lub wiertarki stołowej.

Należy wziąć oczyszczone kwasem szkiełka nakrywkowe i ustawić je pionowo w środowisku wolnym od kurzu, np. w komorze z wyciągiem. Należy pobrać roztwór polyus rozpuszczony w 95% alkoholu i nanieść kilka kropli w pobliżu górnej krawędzi szkiełka nakrywkowego, tylko na jednej z jego połówek. Następnie należy pozostawić poly hema do wyschnięcia. Należy oznaczyć stronę szkiełka nakrywkowego z naniesionym polyus.

Umieść uszczelkę S wokół otworu w dnie naczynia hodowlanego. Przyklej szkiełko podstawowe do naczynia za pomocą uszczelki S. Upewnij się, że poliamid znajduje się wewnątrz oraz że nie ma żadnych przecieków przez szczeliny w uszczelce.

Umieść szkiełko nakrywkę w taki sposób, aby krawędź powłoki z poly hema biegła przez środek naczynia. Pozostaw naczynie do wyschnięcia na dwa do trzech dni, a następnie zadrap dno naczynia rylcem diamentowym, tworząc znaki, które będą służyć jako punkty odniesienia podczas pozycjonowania naczynia na stole mikroskopu. Umieść naczynia w komorze z laminarnym przepływem powietrza i wysterylizuj je pod światłem ultrafioletowym.

Nanieś jedną lub dwie krople roztworu przeciwciał kozich anty-US na stronę płytki bez powłoki polyus, uważając, aby nie rozlać go na powłokę poly hemic, i pozostaw na około trzy godziny. Usuń roztwór i przemyj sterylnym roztworem Ringera. Nanieś roztwór przeciwciał pierwszorzędowych na ten sam obszar i inkubuj przez noc, aby przygotować próbkę do eksperymentu następnego dnia.

Komórki w naszym laboratorium pochodzą z siatkówek salamandry w dorosłej fazie wodnej. Siatkówki są wycinane i usuwane, a następnie trawione enzymatycznie. Na szalkę hodowlaną można następnie wysiać wyizolowane komórki.

Gałki oczne zostają usunięte. Rogówka zostaje wycięta i usunięta. Pozostała część oka zostaje umieszczona w sterylnym roztworze Ringera.

Siatkówkę oddziela się od gałki ocznej, wybierając ją krawędzią zakrzywionej pęsety. Dwutlenek węgla i tlen przedmuchuje się przez roztwór Ringera zawierający propan, a następnie sterylizuje przez ultraprecyzyjny filtr 0,2 mikrona. Siatkówki umieszcza się w roztworze enzymów i trawi przez około 40 minut przy jednoczesnym mieszaniu w celu rozbicia tkanki.

Po trzykrotnym przemyciu siatkówki poddaje się dysocjacji za pomocą trypsyny. Za pomocą pipety z kulką o średnicy 3 mm izoluje się komórki, przygotowując je do wysiewania. Płytkę hodowlaną z pożywką umieszcza się na stoliku mikroskopu i odpowiednio orientuje, korzystając z oznaczeń w postaci zarysowań na dnie płytki.

Pozwala to na powtórzenie dokładnej pozycji szalki w przyszłości. Następnie komórki wysiewa się na obie strony szalki: pokrytą poly hema oraz cell one. Pozycja szalki na stole mikroskopu, jak również moc lasera, są kontrolowane za pomocą dżojstika.

W pierwszej kolejności zidentyfikowano komórkę przylegającą do jednej ze ścianek naczynia. Jest to multipolarna komórka siatkówki, którą można rozpoznać po jej dendrytach. Współrzędne położenia komórki zostały zapisane.

Jest to komórka fotoreceptora pręcikowego znajdująca się po stronie naczynia z repelentem komórkowym Polyus. Naczynie zostaje obniżone, a komórka zostaje pochwycona przez laser i uniesiona ponad dno naczynia. Obecnie komórka jest transportowana na drugą stronę naczynia, do współrzędnych komórki wielobiegunowej.

W rzeczywistości komórka pozostaje nieruchoma. Porusza się naczynie. Komórka przechodzi obecnie przez krawędź powłoki z poly hemo.

Wypustka wyciągająca się z komórki to zakończenie aksonu. Komórka znajduje się wyraźnie powyżej wszelkich zanieczyszczeń i innych komórek na dnie naczynia, które mogłyby przeszkodzić w jej ruchu. W tle widoczne są nieostre obrazy komórek znajdujących się na dnie naczynia.

Komórka pręcikowa dociera do komórki multipolarnej i może zostać precyzyjnie umieszczona w pożądanym punkcie oraz w określonej odległości od tej komórki. Naczynie zostaje podniesione, a komórka przylega do podłoża komórkowego. Głównymi zaletami tej procedury są możliwość wyboru komórek do przeniesienia oraz fakt, że manipulacje mogą odbywać się w zamkniętym, sterylnym układzie doświadczalnym.

Interakcje międzykomórkowe można monitorować za pomocą wideowideonagrań poklatkowych lub fotografii cyfrowej. Pincety laserowe można stosować z dowolną techniką biologiczną. Tutaj, na przykład, technika fluorescencyjna wykazuje obecność białek synaptycznych w punktach połączeń między komórkami przemieszczanymi za pomocą pincet.