Name: Używanie pęsety laserowej do manipulowania izolowanymi neuronami in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-11T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Poznaj manipulację neuronami in vitro za pomocą pęsety laserowej w badaniach neurobiologicznych. Ta precyzyjna metoda optyczna pozwala na przechwytywanie i przemieszczanie komórek nerwowych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania były wspierane przez granty NIH EY012031 i EY0182175 oraz Fundację F.M. Kirby.

Pincety optyczne do manipulowania izolowanymi komórkami w hodowli
Siły pułapkowania w pęsetach optycznych powstają z pędu światła (Ashkin, 1991; Ashkin et al., 1986). Chociaż siły te łatwo pułapkują komórki w zawiesinie, nie są one w stanie przemieścić komórek przylegających do powierzchni. Dlatego, aby zmniejszyć adhezję do szalki hodowlanej w miejscu pułapkowania komórek, szkiełko nakrywkowe pokrywa się poli(2-hydroksyetylometakrylanem) (poly-HEMA) (Sigma Chemical Co., St Louis, MO) – nietoksycznym związkiem o właściwościach odpychających komórki, wykorzystywanym wcześniej w badaniach nad adhezją komórek śródbłonka (Folkman and Moscona, 1978). Podczas gdy poly-HEMA pokrywa jedną połowę szalki hodowlanej, druga połowa jest powlekana podłożem wspierającym wzrost komórek. W naszym laboratorium jako podłoże do hodowli komórek siatkówki salamandry stosuje się Sal-1. Procedura przygotowania szalek pokrytych Sal-1 oraz poly-HEMA opisana jest poniżej:
Przygotowanie naczyń hodowlanych
<ol>
<li>Oczyścić krawędki szkiełek podstawowych (#1 VWR Scientific Inc., Media, PA) w kwasie. Wybrano te szkiełka ze względu na ich grubość wynoszącą zaledwie 0.1mm, co jest niezbędne dla obiektywów o wysokiej aperturze numerycznej wymaganych do ogniskowania lasera.</li>
<li>Aby stworzyć obszar odpychający komórki, rozpuścić 20 mg poly-HEMA (Sigma Chemical Co., St Louis, MO) w 1ml 95% etanolu przez noc w temperaturze pokojowej. Zaleca się, aby roztwór ten został użyty w ciągu 1 miesiąca od przygotowania.</li>
<li>Ustawić szkiełka podstawowe niemal pionowo w środowisku wolnym od kurzu, np. w dygestorium.</li>
<li>Nanieść jedną lub dwie krople roztworu poly-HEMA w pobliżu górnej krawędzi szkiełka za pomocą końcówki mikropipety o objętości 200μl. Krople (około 50-100µl każda) powinny ograniczać się do jednej połowy szkiełka. Duży kąt nachylenia zapewnia spływanie cieczy po powierzchni szkiełka do dołu, co pozwala na uzyskanie cienkiej, równomiernej warstwy poly-HEMA. Pozostawić pokryte poly-HEMA szkiełka do wyschnięcia w dygestorium przez 30-60 minut w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Oznaczyć stronę pokrytą poly-HEMA na szkle cienkopisem blisko krawędzi.</li>
<li>Wywiercić otwór o średnicy 1 cm w dnie naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm.</li>
<li>Przykleić szkiełko pokryte poly-HEMA do dna naczynia hodowlanego za pomocą Sylgard 184 (Dow Corning Co., Midland, MI) w taki sposób, aby strona z poly-HEMA była skierowana do wnętrza naczynia. Należy upewnić się, że krawędź powłoki poly-HEMA przebiega przez środek otworu. Pozostawić naczynia do wyschnięcia na 1-3 dni w temperaturze pokojowej w środowisku wolnym od kurzu.</li>
<li>Narysować linię na zewnętrznej stronie szkiełka za pomocą rysika diamentowego, prowadząc go wzdłuż krawędzi powłoki poly-HEMA. Następnie narysować dwie przecinające się linie prostopadle do niej w odstępie około 2mm. Dwa punkty przecięcia służą jako punkty referencyjne (fiducyjne), które pozwalają na odtworzenie tej samej orientacji naczynia hodowlanego na stoliku mikroskopu.</li>
<li>Sterylizować naczynia pod światłem ultrafioletowym przez noc.</li>
<li>Aby stworzyć połowę naczynia hodowlanego przylegającą do komórek, pokryć połowę niepokrytą poly-HEMA preparatem Sal-1, który zawiera mysie przeciwciało przeciwko salamandrze opracowane przeciwko błonom komórkowym siatkówki (uprzejmie udostępnione przez dr. Petera MacLeisha, Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA; patrz MacLeish et al. (1983)).&nbsp; Najpierw pokryć stronę Sal-1 około 100µl sterylnego przeciwciała koziego anty-mysiego IgG o stężeniu 0.1 mg/ml (Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis IN), uważając, aby ciecz nie przelała się na stronę z poly-HEMA. Pozostawić na trzy godziny, a następnie usunąć. Przemyć ten sam obszar sterylnym roztworem Ringera raz lub dwa razy,&nbsp;następnie nanieść 100µl supernatantu Sal-1, dbając o to, aby ciecz nie przedostała się na stronę z poly-HEMA. Pierwsze przeciwciało zapewnia pokrycie Sal-1 w znanym stężeniu.</li>
<li>Inkubować naczynia z Sal-1 przez noc.</li>
<li>Usunąć roztwór przeciwciała Sal-1 i wypłukać obszar sterylnym roztworem Ringera. Przed samym wysianiem komórek wprowadzić do naczynia 2 ml pożywki.</li>
</ol>
Skład roztworu Ringera dla płazów, bezsurowiczego medium dla płazów oraz roztworu Ringera do trawienia enzymatycznego znajduje się w publikacjach MacLeish i Townes-Anderson (1988) oraz Mandell i wsp. (1993).
Przygotowanie kultur komórkowych
Komórki użyte w tym filmie pochodziły od dorosłych, zaadaptowanych do światła salamander tygrysich w fazie wodnej (Ambystoma tigrinum), o długości 17–22 cm (Charles Sullivan Inc., Nashville, TN), utrzymywanych w temperaturze 5°C w cyklu światło-ciemność 12 h:12 h. Protokoły zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na University of Medicine and Dentistry of New Jersey w ścisłej zgodności z wytycznymi National Institutes of Health. Procedury przygotowania kultur komórek siatkówki zostały opisane przez Nachman-Clewner i Townes-Anderson (1996) i przebiegają w następujący sposób:
<ol>
<li>Zdekapituj i przeprowadź pithing zwierząt. Usuń gałki oczne, a następnie wypreparuj rogówki i tęczówki. Siatkówki powinny być lekko oddzielone od ścianki gałki ocznej. Używając zakrzywionej pęsety umieszczonej pod siatkówką, wyjmij siatkówki. Na tym etapie nie ma znaczenia, czy soczewka pozostaje przytwierdzona do siatkówki.</li>
<li>Traw siatkówki w roztworze papainy o stężeniu 14 U/ml (Worthington, Freehold, NJ) w roztworze Ringera dla salamandry przez 40 min.</li>
<li>Przed użyciem roztwór Ringera z papainą należy napowietrzać mieszaniną gazów 95% O2 / 5% CO2&nbsp; przez 30 min, a następnie wysterylizować, przepuszczając przez filtr 0,22 mikrona (Millipore, Carrigtwohill, Irlandia).</li>
<li>Przepłucz siatkówki sterylnym roztworem Ringera dla salamandry trzykrotnie.</li>
<li>Wyjmij preparaty z roztworu Ringera, a następnie delikatnie rozcieraj tkankę siatkówki za pomocą pipety o średnicy 3 mm, aby uzyskać zawiesinę komórkową.</li>
</ol>
Manipulacja wyizolowanymi neuronami za pomocą pęsety laserowej
<ol>
<li>Umieść naczynie hodowlane na stoliku mikroskopu, orientując je poprzez dopasowanie znaku na naczyniu do punktu odniesienia na stoliku. Zapisz współrzędne punktów referencyjnych w komputerze.</li>
<li>Wysej komórki na obie połowy naczynia: Sal-1 oraz poly-HEMA.</li>
<li>Pozostaw komórki na około 20 mins, aby osiadły; jest to czas wystarczający do przywierania komórek na adhezyjnej stronie naczynia do podłoża przeciwciał.</li>
<li>Wybierz komórkę po adhezyjnej stronie Sal-1 naczynia. Zaznacz współrzędne x i y stolika w pozycji blisko komórki. W naszym przypadku punkt ten znajdował się w odległości około 10µm od dendrytów pierwotnych wybranej komórki. Zapisz współrzędne w komputerze.</li>
<li>Wybierz drugi neuron, w naszym przypadku fotoreceptor, po stronie poly-HEMA naczynia i użyj pęsety laserowej do jego przechwycenia.&nbsp; Przechwycenie można osiągnąć w szerokim zakresie poziomów mocy. Ustawiliśmy jednak moc lasera na 10%–20%, co jest wartością wystarczająco niską, aby uniknąć przechwytywania zanieczyszczeń wraz z komórką, ale wystarczającą do transportu komórki przez medium.</li>
<li>Trzymając komórkę w pułapce, obniż stolik tak, aby komórka znajdowała się znacznie powyżej powierzchni naczynia hodowlanego i powyżej wszystkich przywierających neuronów. Przesuń stolik pod kontrolą komputera, aby doprowadzić komórkę do wcześniej zapisanych współrzędnych x i y po stronie Sal-1. Prędkość ruchu stolika ustawiono na 8–20µm/s, jednak maksymalna prędkość powinna zostać określona empirycznie. Po dotarciu do punktu docelowego po stronie Sal-1, podnieś stolik, aby zbliżyć przechwyconą komórkę do powierzchni naczynia. Umiejscowienie komórki można wykonać z dokładnością do kilku mikronów. Pozostaw komórkę do czasu przywiernięcia do podłoża Sal-1.</li>
<li>Uzyskanie zdigitalizowanych obrazów obu komórek w parze przed i po sformowaniu pary stanowi użyteczną dokumentację.</li>
<li>Utrzymuj pary komórek w inkubatorze. W przypadku komórek salamandry umieść naczynia w komorze nawilżanej w temperaturze 10°C. Komórki mogą być monitorowane za pomocą poklatkowego nagrywania wideo i wykorzystywane w dowolnej wymaganej technice biologii komórki.</li>
</ol>

<ol><li>Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+a+Single-Beam+Gradient+Force+Optical+Trap+for+Dielectric+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Observation of a Single-Beam Gradient Force Optical Trap for Dielectric Particles.</a> Opt. Lett. 11, 288-290 (1986).</li>
<li>Clarke, R. J., Hoegnason, K., Brimacombe, M., Townes-Anderson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+and+rod+cells+have+different+target+preferences+in+vitro+as+revealed+by+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vision%22%5BJournal%5D)">Cone and rod cells have different target preferences in vitro as revealed by optical tweezers.</a> Mol. Vision. 14, 706-720 (2008).</li>
<li>Folkman, J., Moscona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cell+shape+in+growth+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of cell shape in growth control.</a> Nature. 273, 345-349 (1978).</li>
<li>Liu, Y., Cheng, D. K., Soneck, G. J., Berns, M. W., Chapman, C. F., Tromberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+localized+cell+heating+induced+by+infrared+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Evidence of localized cell heating induced by infrared optical tweezers.</a> Biophysical Journal. 68, 2137-2144 (1995).</li>
<li>MacLeish, P. R., Barnstable, C. J., Townes-Anderson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+monoclonal+antibody+as+a+substrate+for+mature+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 7014-7018 (1983).</li>
<li>MacLeish, P. R., Townes-Anderson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+synapse+formation+among+major+classes+of+adult+salamander+retinal+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Growth and synapse formation among major classes of adult salamander retinal neurons in vitro.</a> Neuron. 1, 751-760 (1988).</li>
<li>Mandell, J. W., MacLeish, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Townes-Anderson+E.+Process+outgrowth+and+synaptic+varicosity+formation+by+adult+photoreceptors+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Townes-Anderson E. Process outgrowth and synaptic varicosity formation by adult photoreceptors in vitro.</a> J. Neurosci. 13, 3533-3548 (1993).</li>
<li>Nachman-Clewner, M., Townes-Anderson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury-induced+remodelling+and+regeneration+of+the+ribbon+presynaptic+terminal+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Injury-induced remodelling and regeneration of the ribbon presynaptic terminal in vitro.</a> J. Neurocytol. 25, 597-613 (1996).</li>
<li>Townes-Anderson, E., St Jules, R. S., Sherry, D. M., Lichtenberger, J., Hassanain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromanipulation+of+retinal+neurons+by+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis.%22%5BJournal%5D)">Micromanipulation of retinal neurons by optical tweezers.</a> Mol. Vis.. 4, (1998).</li>
</ol>

Światło posiada pęd, a gdy promień świetlny ulega refrakcji przechodząc przez komórkę, wymagana jest siła, aby zmienić kierunek tego pędu. Zgodnie z prawem zachowania pędu, siła o przeciwnym kierunku musi w zamian oddziaływać na komórkę. Ashkin (1991) wykazał, że siła generowana przez wiązkę laserową skupioną przez obiektyw mikroskopu przesuwa komórkę w stronę centrum ogniska. Mimo że wiązka laserowa generuje zaledwie kilka pikonิวtonów siły, jest ona wystarczająca, aby przeciągnąć komórkę przez ośrodek. W celu uniknięci...

<table><tbody><tr><td> rondelka z deactivate szkła kryształowego nr 1, 25mm</td><td>VWR international</td><td>48380 080</td><td></td></tr><tr><td>poli-2-hydroksyetylometakrylan (poly-HEMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3932</td><td>rozpuścić w 95% etanolu</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciała anty-mysie IgG</td><td>Chemicon International</td><td>AP181</td><td> 1mg w 1ml, rozcieńczyć 10x przed użyciem</td></tr><tr><td>naddatek Sal-1 zawierający mysie przeciwciała anty-salamandrowe</td><td>uprzejmie dostarczone przez dr. Petera MacLeisha</td><td></td><td>dr Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA</td></tr><tr><td>jednorazowe pipety pyrex o średnicy otworu 3 mm i pojemności 5ml</td><td>Corning</td><td>7078A-5</td><td></td></tr><tr><td>szalki do hodowli komórkowej 35mm x 10mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>zestaw elastomeru silikonowego Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pinceta optyczna-mikronarzędzie lub pinceta laserowa</td><td>Cell Robotics Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>laser diodowy w trybie ciągłym o mocy 1 W i długości fali 980nm</td><td>Cell Robotics Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>odwrócony mikroskop świetlny Axiovert 100</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>obiektyw plan neofluor z immersją olejową 40x</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>apertura numeryczna (N.A. 1.3)</td></tr><tr><td>czarno-biała kamera CCD</td><td>Sony Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>komputer i joystick z oprogramowaniem</td><td>Cell Robotics Inc.</td><td></td><td>do sterowania zmotoryzowanym stolikiem</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie pęsety laserowej do manipulowania izolowanymi neuronami in vitro

Using Laser Tweezers For Manipulating Isolated Neurons In Vitro

W niniejszej pracy i filmie opisujemy protokoły stosowane w naszym laboratorium do badania preferencji kierunkowych regenerujących się wypustek komórkowych dorosłych neuronów siatkówki in vitro. Procedury przygotowania kultur komórek siatkówki rozpoczynają się od wycięcia, trawienia i trituracji siatkówki, a kończą na wysiewaniu wyizolowanych komórek siatkówki na szalki wykonane specjalnie do zastosowań z pęsetą laserową. Szalki te są podzielone na połowę adhezyjną dla komórek oraz połowę repelującą komórki. Strona adhezyjna jest pokryta warstwą przeciwciał Sal-1, które stanowią podłoże umożliwiające wzrost komórek. W przypadku innych typów komórek można zastosować inne podłoża adhezyjne. Strona repelująca jest pokryta cienką warstwą poly-HEMA. Komórki wysiane na stronę z poly-HEMA są chwytane pęsetą laserową, transportowane, a następnie umieszczane obok komórki na stronie z Sal-1 w celu utworzenia pary. Dzięki tej technice możliwe powinno być tworzenie grup komórek o dowolnym rozmiarze. „Mikromanipulacja sterowana pęsetą laserową” oznacza, że badacz może wybrać, które komórki przenieść, a pożądana odległość między komórkami może zostać ustandaryzowana. Ponieważ wiązka lasera przechodzi przez przezroczyste powierzchnie naczynia hodowlanego, wybór i rozmieszczenie komórek odbywają się w zamkniętym, sterylnym środowisku. Komórki mogą być monitorowane za pomocą wideografii time-lapse i poddawane dowolnej wymaganej technice biologii komórki. Technika ta może pomóc w badaniach nad oddziaływaniami międzykomórkowymi.

W tym filmie opisano manipulację hodowanymi neuronami z wykorzystaniem pęsety laserowej in vitro.

Wykorzystanie pęsety laserowej do manipulowania izolowanymi neuronami in vitro

W niniejszej pracy i filmie opisujemy protokoły stosowane w naszym laboratorium do badania preferencji celowania regenerujących się wypustek komórkowych u dorosłych ...

Ashkin był pierwszą osobą, która wykazała, że pęsety laserowe lub pułapki optyczne stanowią potężne narzędzie do manipulowania mikroskopijnymi, zminiaturyzowanymi obiektami żywymi. W tym filmie pokażemy, w jaki sposób zastosowaliśmy tę technologię do wychwytywania i przemieszczania neuronów. Oto stanowisko pracy z pęsetą optyczną.Zielone strzałki pokazują drogę wiązki lasera przechodzącej przez optykę mikroskopu. Gdy wiązka lasera skupiona przez obiektyw mikroskopu ulega refrakcji w komórce, siła zmieniająca kierunek promienia świetlnego działa na komórkę, przesuwając ją w stronę centrum ogniska.Generuje to siłę rzędu pikoniutonów, wystarczającą do przemieszczania komórki w medium. W tym filmie omówimy wykonanie szalek, przygotowanie komórek siatkówki, wysiewanie komórek na hodowlane szalki, manipulację za pomocą pęsety laserowej oraz obserwację wzrostu komórek. Ponieważ komórki przylegają do szkła, musieliśmy stworzyć obszar odpychający komórki, w którym można je łatwo chwytać za pomocą pęsety.Połowę płytki pokryto poly hema, polimerem odpychającym komórki. Druga połowa została pokryta cell one, podłożem wspierającym wzrost naszych komórek. W pierwszej kolejności identyfikuje się

using-laser-tweezers-for-manipulating-isolated-neurons-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zastosowanie laserowych szczypiec do manipulowania izolowanymi neuronami in vitro

W niniejszym artykule wideo przedstawiamy metodę izolacji pojedynczych lub wielu neuronów dopaminergicznych (da) Drosophila z larw trzeciego stadium za pomocą mikrodysekcji laserowej (LCM) w klasie przechwytywania podczerwienią (IR). RNA uzyskane z wyizolowanych neuronów może być łatwo wykorzystane w dalszych zastosowaniach, w tym w analizach qRT-PCR lub mikromacierzach.

Mikrodysekcja laserowa neuronów obwodowych Drosophila

Przedstawiono protokół przecinania neuronów u C. elegans przy użyciu impulsowego lasera MicroPoint. Opisujemy konfigurację systemu, unieruchamianie nicieni oraz przecinanie znakowanych neuronów. Zalety obejmują relatywnie niski koszt systemu oraz możliwość przecinania wypustek neuronalnych lub ablacji komórek in vivo.

In vivo laserowa aksonotomia u C. elegans

Ten film demonstruje metodę izolowania fluorescencyjnie znakowanych neuronów z mózgu myszy.

Izolowanie fluorescencyjnie znakowanych neuronów z mysiego mózgu

Źródło: Morsch, M.,  , Wywoływanie stresu i śmierci komórki za pomocą konwencjonalnej laserowej mikroskopii konfokalnej UV. J. Vis. Exp. (2017)...

Selektywna ablacja laserowa pojedynczego neuronu u larwy danio pręgowanego przy użyciu mikroskopu konfokalnego

Niedawny rozwój narzędzi neuronauki, które łączą genetykę i optykę, określany jako "optogenetyka", umożliwia kontrolę nad aktywnością obwodów neuronowych z niespotykanym dotąd poziomem rozdzielczości przestrzennej i czasowej. W tym miejscu przedstawiamy protokół integracji zapisu in vivo z manipulacją optogenetyczną genetycznie zdefiniowanych podzbiorów neuronów przedczołowych korowych i podkostnych neuronów piramidowych.

Metoda wysokiej wierności optogenetycznej kontroli pojedynczych neuronów piramidowych in vivo

Zmierzyliśmy spadek napięcia w aksonie, który został częściowo uszkodzony za pomocą laserowego dysektora, za pomocą jednoczesnego pomiaru spektroskopii siły wykonanego na optycznie uwięzionej sondzie przyklejonej do membrany aksonu. Opracowany protokół eksperymentalny ocenia adhezję aksonów do substratu hodowli.

Pomiar zwolnienia napięcia podczas uszkodzenia aksonu indukowanego laserem w celu oceny adhezji aksonów do podłoża z rozdzielczością pikontonów i milisekund

Ludzkie komórki neuroprogenitorowe (NPC) były rozwijane w warunkach proliferacji. NPC różnicowano w kultury bogate w neurony w obecności kombinacji neurotrofin. Markery neuronalne wykryto za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Aby wyizolować czystą populację neuronów, NPC różnicowano na szkiełkach membranowych PEN i przeprowadzono mikrodysekcję wychwytywania laserowego.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji neuronów ze zróżnicowanych ludzkich komórek neuroprogenitorowych w hodowli

Opisujemy metodę charakteryzowania funkcjonalnej topografii i właściwości synaptycznych obwodów przodomózgowia za pomocą podejścia optogenetycznego do fotostymulacji populacji neuronów in vitro.

Fotostymulacja optogenetycznie ukierunkowana obwodów przodomózgowia ze skaningiem laserowym

Obrazowanie dwufotonowe, sprzężone z nanodysekcją laserową, są użytecznymi narzędziami do badania procesów zwyrodnieniowych i regeneracyjnych w ośrodkowym układzie nerwowym z rozdzielczością subkomórkową. Protokół ten pokazuje, jak oznaczać, obrazować i preparować pojedyncze włókna pnące w korze móżdżku in vivo.

Laserowa nanochirurgia aksonów móżdżku in vivo

Izolacja pojedynczych neuronów dopaminowych lub brzusznego obszaru nakrywki za pomocą bezpośredniej lub pośredniej immunohistochemii jest demonstrowana za pomocą mikrodysekcji laserowej. Omówiono parametry izolacji tkanki ze szkiełka podstawowego za pomocą lasera na podczerwień oraz od szkiełek membranowych z wykorzystaniem kombinacji lasera podczerwonego i ultrafioletowego.

Mikrodysekcja laserowa - demonstracja izolacji pojedynczych neuronów dopaminowych i całego brzusznego obszaru nakrywki

Opisujemy technikę oznaczania neuronów i ich procesów poprzez iniekcje śladowe do jąder mózgowych za pomocą preparatu in vitro. Zmodyfikowaliśmy istniejącą metodę elektroporacji znaczników invitro, wykorzystując znakowane fluorescencyjnie mutanty myszy i podstawowy sprzęt optyczny w celu zwiększenia dokładności znakowania.

Laserowe śledzenie neuronów w eksplantatach mózgu

Poznaj manipulację neuronami in vitro za pomocą pęsety laserowej w badaniach neurobiologicznych. Ta precyzyjna metoda optyczna pozwala na przechwytywanie i przemieszczanie komórek nerwowych w czasie rzeczywistym.

Wykorzystanie pęsety laserowej do manipulowania izolowanymi neuronami in vitro

Przeglądaj więcej filmów