Badanie biogenezy błon za pomocą testu z genem reporterowym opartym na lucyferazie

Witajcie, zajmuję się badaniem koordynacji różnych szlaków syntezy lipidów w procesach pamięci i biogenezy. Przydatne jest posiadanie systemu eksperymentalnego, w którym biogeneza błon zachodzi szybko i jest indukowalna. Stwierdziliśmy, że fagocytoza kulek lateksowych jest szczególnie użyteczna w takich badaniach, ponieważ komórki bardzo szybko syntetyzują nowe błony, aby uzupełnić te, które zostały utracone jako materiał otaczający we wczesnej fazie procesu pochłaniania.

W tym filmie mój kolega Ong Zang zaprezentuje procedury wykorzystywane do badania zmian w ekspresji genów indukowanych przez fagocytozę, z zastosowaniem podejścia opartego na teście reporterowym z użyciem lucyferazy. Cześć, nazywam się X z laboratorium exon North w Departamencie Biologii Molekularnej i Komórkowej na Uniwersytecie Harvarda. Dzisiaj pokażę Państwu, jak wykorzystać test z genem reporterowym do analizy regulacji genów zaangażowanych w biogenezę błon po fagocytozie. Zacznijmy zatem.

W tej procedurze wykorzystujemy hodowle ludzkich komórek embrionalnej nerki 293. Komórki te są hodowane w 10 centymetrowych naczyniach hodowlanych w pożywce A, która składa się z DMEM (basal modified eagle's medium) uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz koktajl antybiotyków. Przy zastosowaniu techniki standaryzacji komórki są odrywane od dna naczynia, przeliczane, a następnie wysiewane na pokryte polilizyną płytki 96-dołkowe, gdzie są hodowane przez 24 godziny do czasu rozpoczęcia transfekcji.

W przypadku transfekcji rutynowo wykonujemy wszystkie warunki w trzech powtórzeniach, a całkowita ilość plasmidowego DNA na dołek wynosi od 50 do 100 nanogramów. Mieszaniny plasmidów powinny zawierać co najmniej konstrukt raportujący wykazujący ekspresję lucyferazy świetlikowej oraz plasmid kontrolny wykazujący ekspresję lucyferazy z promotora konstytutywnego. W celu rozpoczęcia przygotować mieszaninę pożywki DMEM z surowicą i antybiotykami oraz odczynnika do transfekcji Transfecta 2K, stosując 10 µL DMEM na każdy dołek przeznaczony do transfekcji oraz 3 µL odczynnika Transfecta 2K na każdy mikrogram plasmidowego DNA.

Na przykład, jeśli 20 studzienek ma zostać przetransfekowanych 50 nanogram DNA przy użyciu trzech mikrolitrów odczynnika trans 2 9 3 w 200 mikrolitrach DMEM. Roztwór miesza się poprzez wielokrotne pipetowanie w górę i w dół, a następnie pozostawia w spokoju w temperaturze pokojowej przez co najmniej pięć minut. Następnie DNA przenosi się pipetą do oddzielnych probówek do wirówek mikrocentryfużowych. Stężenia naszych roztworów stokowych plus meter zazwyczaj wynoszą od 10 do 100 nanogram na mikrolitr.

Po pięciominutowej inkubacji mieszaniny DM M, należy przenieść ją do probówki z DNA i ponownie wymieszać roztwór poprzez pipetowanie. Następnie pozostawić próbki w temperaturze pokojowej na 20 minut. Podczas tej 20-minutowej inkubacji należy usunąć pożywkę z 96-dołkowej płytki hodowlanej i zastąpić ją 19 µL świeżej pożywki A; po zakończeniu inkubacji do każdego dołka należy przenieść 10 µL mieszaniny D-M-M-D-N-A.

Mieszaninę należy nanieść pipetą bezpośrednio do istniejącego płynu. Nie należy dopuścić do zetknięcia końcówki pipety ze ścianką probówki. Ważne jest również uwzględnienie trzech studzienek z komórkami, które pozostaną niebadane.

Średnią aktywność lucyferazy w tych studzienkach odniesie się później jako tło. Umieść płytkę 96-dołkową w inkubatorze w temperaturze 37 °C i inkubuj komórki przez 24 godziny. Po zakończeniu 24-godzinnej inkubacji przechodzimy do indukowania biosyntezy błon, biosyntezy kulek lateksowych. Aby rozpocząć, przygotuj zawiesinę zawierającą pożywkę do hodowli komórkowej oraz kulki lateksowe.

Aby to osiągnąć, należy przygotować medium B, które jest mieszaniną w stosunku jeden do jednego DMEM oraz medium F wzbogaconego o antybiotyki i 10% FBS. Następnie dodaje się kulki lateksowe o średnicy 0,75 µm w stężeniach do 1 mg/mL. Oczywiście każdy eksperyment powinien obejmować kontrole, do których nie dodano kulek.

Następnie usuń medium z 96-dołkowej płytki hodowlanej i zastąp je w każdej studzience 100 µL zawiesiny kulek. Po dodaniu zawiesiny wiruj płytkę przez dwie minuty przy 1000 G. Pomaga to skoncentrować kulki na dnie studzienki i ułatwia fagocytozę. Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez okres od 6 do 16 godzin.

W zależności od warunków oraz promotora wykorzystanego do napędzania lucyferazy, zwiększoną ekspresję genu promotora można wykryć po jednej do trzech godzinach. W przypadku niektórych eksperymentów konieczne może być rozdzielenie fal od syntezy lipidów, na przykład w celu zbadania wpływu określonych leków na syntezę lipidów bez wpływania na rządzenie cząsteczkami. W takich przypadkach inkubuj komórki z koralkami od 30 do 16 minut, aby umożliwić komórkom cytozystowanie koralek.

Po tej inkubacji komórki należy przemyć dwukrotnie PBS, aby usunąć niepołączone kuleczki. Następnie dodaje się świeżą pożywkę, a komórki inkubuje się od 6 do 16 godzin w celu ekspresji genu reporterowego. Teraz można przystąpić do przeprowadzenia testów żelazowych.

Aby rozpocząć analizy Lucyferazy, należy przygotować bufor xis zawierający 20 mM Tris-HCl pH 7,8, 10% (v/v) glicerolu oraz 0,5% (v/v) Triton X-100 w ilości odpowiedniej do planowanego eksperymentu. Następnie należy dodać 1 µL na każdy 1 mL 1 M DTT. Pozostałego roztworu DTT nie należy ponownie wykorzystywać.

Następnie dodaj koktajl inhibitorów proteaz do stężenia końcowego od 0,5 do 1x. Przy pierwszym użyciu zestawu Dual-Glo, przygotuj odczynnik lucyferazy świetlika, przenosząc całą zawartość jednej butelki buforu Dual-Glo Luciferase Buffer do jednej butelki substratu Dual-Glo Luciferase Substrate. Podziel niewykorzystany odczynnik lucyferazy na probówki 10 mm i przechowuj w temperaturze -20 °C. Po przygotowaniu odczynnika lucyferazy wyjmij płytkę 96-dołkową z inkubatora do hodowli tkanek i umieść ją na lodzie. Następnie usuń medium poprzez aspirację, dodaj 40 µL buforu lizującego do każdego dołka i pozostaw płytkę na lodzie na 30 minut.

Następnie należało dodać 15 µL odczynnika Lucifer do każdej studzienki. Użyliśmy białej nieprzezroczystej płytki 96-dołkowej Perkin S optive plate 96. Następnie dodano 15 µL lizatu komórkowego i inkubowano płytkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

Po 10 minutach odczytaj luminescencję w czytniku mikropłytek. Następnie przeprowadź analizę lucyferazy waniliowej w celu uzyskania danych dla plazmidu kontrolnego. W tym celu bezpośrednio przed użyciem przygotuj odpowiednią ilość roztworu substratu lucyferazy, dodając jedną część odczynnika Dual-Glo Stop & Glo do 100 części roztworu.

Bufor Dual glow, stop i glow. Następnie do każdej studzienki dodaj 15 µL roztworu substratu. Inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie ponownie zmierz luminescencję.

Należy pamiętać, że zmodyfikowaliśmy zalecany przez producenta protokół dla tych testów Dual Glow Ferous. W celu zmniejszenia ilości odczynników wymaganych do próbki, płytkę można teraz poddać ponownej analizie za pomocą czytnika płytek. Po zebraniu danych za pomocą czytnika mikropłytek można je przenieść do programu arkusza kalkulacyjnego, takiego jak Microsoft Excel, w celu przeprowadzenia dalszej analizy.

Najpierw oblicz średnią z trzech studzienek nieprzetransfekowanych i odejmij tę wartość od każdego z punktów danych. Następnie dla każdej przetransfekowanej studzienki podziel wartość dla lucyferazy świetlikowej przez wartość dla lucyferazy. Następnie dla każdego zestawu próbek powtórzonych trzykrotnie oblicz średnią, odchylenie oraz współczynnik zmienności.

W naszym przykładzie zastosowaliśmy różne stężenia kulek, które naniesiono na oś x, w zestawieniu z stosunkiem aktywności lucyferazy świetlika do lucyferazy z wanilii. Jak widać, występuje zależny od dawki wzrost tego stosunku. Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak wykorzystać reporterowy test genowy oparty na lucyferazie do pomiaru ekspresji z promotora receptora LDL w odpowiedzi na fagocytozę kulek lateksowych.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o tym, aby w momencie transfekcji stopień konfluencji komórek wynosił od 80% do 90%. To już wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzonych eksperymentach.