Name: Badanie biogenezy błony za pomocą testu genu reporterowego opartego na lucyferazie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-07T14:36:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: Poznaj metodę badania biogenezy błony za pomocą testu genu reporterowego opartego na lucyferazie. Technika ta pozwala analizować ekspresję genów po fagocytozie w komórkach HEK293.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Hodowla komórek
<ol>
<li>Kultury macierzyste ludzkich komórek embrionalnych nerki 293 (HEK293) hoduje się w naczyniach hodowlanych o średnicy 10 cm w „medium A”, składającym się z DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) uzupełnionego o koktajl antybiotyków (100 jednostek na ml penicyliny i 100 µg na ml siarczanu streptomycyny) oraz 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).</li>
<li>W celu przygotowania komórek do eksperymentu odsysa się medium, a komórki płucze dwukrotnie 5 ml roztworu soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS).</li>
<li>Następnie usuwa się PBS i zastępuje go 0,6 ml roztworu zawierającego 0,25% trypsyny.</li>
<li>Naczynie inkubuje się w temperaturze 37˚C przez około 2 min, aż komórki zaczną się odrywać.</li>
<li>Dodaje się 5,5 ml medium A w celu neutralizacji trypsyny, a następnie zlicza komórki za pomocą hemocytometru.</li>
<li>Komórki rozcieńcza się do stężenia 320 000 komórek na ml i nanosi po 0,1 ml na studzienkę do 96-dołkowej płytki hodowlanej pokrytej poliłyzyną.</li>
<li>Płytkę umieszcza się w inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37˚C w atmosferze zawierającej 8,8% CO2 i inkubuje przez 24 h.</li>
</ol>
Transfekcje
<ol>
<li>Przygotowując się do transfekcji, należy określić liczbę powtórzeń dla każdego z warunków eksperymentalnych oraz ilość plazmidu do transfekcji. Standardowo wszystkie warunki wykonujemy w trzech powtórzeniach, transfekując łącznie od 50 do 100 ng DNA plazmidowego na dołek. Mieszaniny plazmidów powinny zawierać co najmniej konstrukt reporterowy wykazujący ekspresję lucyferazy świetlika oraz plazmid kontrolny wykazujący ekspresję lucyferazy Renilla pod promotorem konstytutywnym.</li>
<li>Roztwory plazmidów przenosi się pipetą do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml i uzupełnia o 10 µl na próbkę medium DMEM bez surowicy i antybiotyków. Na przykład, jeśli 20 dołków ma zostać poddanych transfekcji ilością 50 µg DNA, należy dodać 200 µl DMEM do 1 µg DNA.</li>
<li>Do roztworu DMEM/DNA dodaje się 3 µl „odczynnika TransIT 293” (Mirus) na każdy 1 µg DNA. Należy wymieszać zawartość poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie pozostawić próbki w temperaturze pokojowej na co najmniej 10 min.</li>
<li>W tym czasie należy usunąć medium z płytki hodowlanej 96-dołkowej i zastąpić je 90 µl świeżego medium A.</li>
<li>Do każdego dołka dodaje się 10 µl mieszaniny DMEM/DNA/TransIT 293.</li>
<li>Płytkę należy umieścić w inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37˚C w atmosferze zawierającej 8,8% CO2 i inkubować przez 24 h.</li>
</ol>
Fagocytoza
<ol>
<li>Przygotować zawiesiny zawierające medium B (mieszaninę DMEM i medium Ham’s F12 w stosunku 1:1, z dodatkiem antybiotyków i 10% FBS) oraz kuleczki lateksowe 0,75-µm w stężeniu od 0 do 1 mg/ml.</li>
<li>Usunąć podłoża z 96-dołkowej płytki hodowlanej i zastąpić je 0,1 ml zawiesin z kuleczkami w medium B.</li>
<li>Wirować płytkę przez 2 min przy 1000 ×g.</li>
<li>Następnie komórki hodować w temperaturze 37˚C przez 6 do 16 h. W zależności od warunków i promotora sterującego lucyferazą, zwiększoną ekspresję genu reporterowego można wykryć po 1 do 3 h.</li>
<li>W niektórych przypadkach może być konieczne inkubowanie komórek z kuleczkami przez 30 do 60 min, a następnie wykonanie 2 płukań PBS w celu usunięcia nieprzyłączonych kuleczek i dodanie świeżego podłoża przed inkubowaniem komórek przez kolejne okresy czasu.</li>
</ol>
Test Lucyferazy Dual-GloTM
<ol>
<li>Uwaga: nasz protokół korzystania z tego zestawu różni się w niektórych aspektach od zaleceń producenta. Został on zmodyfikowany w celu zmniejszenia ilości odczynników wymaganych na jedną próbkę.</li>
<li>Przygotować roztwór 1 M DTT, podzielić na kilka małych alikwotów i przechowywać w temperaturze -20˚C.</li>
<li>Przygotować bufor do lizy zawierający 20 mM Tris-HCl (pH 7.8), 10% (v/v) glicerolu oraz 0,5% (v/v) Triton X-100. Przed użyciem odmierzyć ilość potrzebną do eksperymentu i dodać 1 µl na ml 1 M DTT oraz koktajl inhibitorów proteaz do stężenia końcowego od 0,5 do 1x. Nie używać ponownie pozostałego roztworu DTT.</li>
<li>Przy pierwszym użyciu zestawu Dual-GloTM należy przygotować odczynnik lucyferazowy (świetlika), przenosząc całą zawartość jednej butelki buforu Dual-GloTM Luciferase Buffer (załączonego do zestawu) do jednej butelki substratu Dual-GloTM Luciferase Substrate (załączonego do zestawu). Niewykorzystany odczynnik lucyferazowy podzielić na alikwoty po 10 ml i przechowywać w temperaturze -20˚C.</li>
<li>Wyjąć płytkę 96-dołkową z inkubatora do hodowli tkanek i umieścić ją na lodzie. Usunąć pożywkę poprzez aspirację, dodać 40 µl buforu do lizy na dołek, a następnie pozostawić płytkę na lodzie na 30 min.</li>
<li>W białej, nieprzezroczystej płytce 96-dołkowej (OptiplateTM-96, numer katalogowy Perkin Elmer 6005290) odmierzyć 15 µl odczynnika lucyferazowego na dołek, a następnie dodać 15 µl lizatu komórkowego.</li>
<li>Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 10 min, a następnie odczytać luminescencję w czytniku mikro płytek.</li>
<li>Bezpośrednio przed użyciem przygotować odpowiednią ilość roztworu substratu lucyferazy Renilla, dodając 1 część odczynnika Dual-GloTM Stop &amp; Glo® Reagent (załączonego do zestawu) do 100 części buforu Dual-GloTM Stop &amp; Glo® Buffer (załączonego do zestawu).</li>
<li>Do każdego dołka dodać 15 µl roztworu substratu lucyferazy Renilla, inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min, a następnie ponownie zmierzyć luminescencję.</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych informacji do ujawnienia.

badanie biogenezy błon za pomocą testu z genem reporterowym opartym na lucyferazie

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

Aby zbadać koordynację różnych szlaków syntezy lipidów podczas biogenezy błon, warto zastosować system eksperymentalny, w którym biogeneza błon zachodzi szybko i w sposób indukowalny. Stwierdzono, że fagocytoza kulek lateksowych jest praktyczna do tych celów, ponieważ komórki szybko syntetyzują lipidy błonowe, aby uzupełnić zasoby błon utracone jako materiał otaczający podczas pochłaniania cząstek. W niniejszej pracy opisujemy procedury badania zmian w ekspresji genów indukowanej fagocytozą z wykorzystaniem podejścia opartego na genach reporterowych lucyferazy przy użyciu systemu Dual-Glo Luciferase Assay System firmy Promega.

W niniejszej pracy opisujemy procedury badania zmian w ekspresji genów indukowanej fagocytozą z wykorzystaniem podejścia opartego na genach reporterowych lucyferazy, stosując system Dual-GloTM Luciferase Assay System firmy Promega.

Badanie biogenezy błon za pomocą testu z genem reporterowym opartym na lucyferazie

Aby zbadać koordynację różnych szlaków syntezy lipidów podczas biogenezy błon, warto wykorzystać system eksperymentalny, w którym błona ...

Witajcie, zajmuję się badaniem koordynacji różnych szlaków syntezy lipidów w procesach pamięci i biogenezy. Przydatne jest posiadanie systemu eksperymentalnego, w którym biogeneza błon zachodzi szybko i jest indukowalna. Stwierdziliśmy, że fagocytoza kulek lateksowych jest szczególnie użyteczna w takich badaniach, ponieważ komórki bardzo szybko syntetyzują nowe błony, aby uzupełnić te, które zostały utracone jako materiał otaczający we wczesnej fazie procesu pochłaniania.W tym filmie mój kolega Ong Zang zaprezentuje procedury wykorzystywane do badania zmian w ekspresji genów indukowanych przez fagocytozę, z zastosowaniem podejścia opartego na teście reporterowym z użyciem lucyferazy. Cześć, nazywam się X z laboratorium exon North w Departamencie Biologii Molekularnej i Komórkowej na Uniwersytecie Harvarda. Dzisiaj pokażę Państwu, jak wykorzystać test z genem reporterowym do analizy regulacji genów zaangażowanych w biogenezę błon po fagocytozie. Zacznijmy zatem.W tej procedurze wykorzystujemy hodowle ludzkich komórek embrionalnej nerki 293. Komórki te są hodowane w 10 centymetrowych naczyniach hodowlanych w pożywce A, która składa się z DMEM (basal modified eagle's medium) uzupełnio

studying-membrane-biogenesis-with-luciferase-based-reporter-gene

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Badanie biogenezy błony za pomocą testu genu reporterowego opartego na lucyferazie

W związku z rosnącym zainteresowaniem terapiami komórkami macierzystymi, techniki obrazowania molekularnego są idealne do monitorowania zachowania tych komórek po transplantacji. Geny reporterowe lucyferazy umożliwiły nieinwazyjną, powtarzalną ocenę przeżywalności, lokalizacji i proliferacji komórek in vivo. W niniejszym filmie zaprezentrowano sposób śledzenia proliferacji hESC w żywej myszy.

Obrazowanie genem reporterowym bioluminescencyjnym ludzkich embrionalnych komórek macierzystych in vitro i in vivo

Zegary okołodobowe funkcjonują w obrębie poszczególnych komórek, tzn. są autonomiczne komórkowo. W niniejszej pracy opisujemy metody tworzenia autonomicznych komórkowo modeli zegara z wykorzystaniem nieinwazyjnej technologii bioluminescencji w czasie rzeczywistym opartej na lucyferazie. Komórki reporterowe stanowią praktyczne, funkcjonalne systemy modelowe do badania biologii okołodobowej.

Monitorowanie komórkowych autonomicznych rytmów okołodobowych ekspresji genów z wykorzystaniem reporterów bioluminescencyjnych lucyferazy

Film demonstruje test lucyferazy używany do ilościowego oznaczania białek znakowanych lucyferazy. W teście wykorzystuje zmodyfikowany enzym lucyferazy składający się z dużego fragmentu, który wiąże się z małym fragmentem, który jest sprzężony z interesującym białkiem. Związane podjednostki tworzą aktywny enzym, który w obecności substratu uwalnia sygnał luminescencyjny. Sygnał ten jest następnie oznaczany ilościowo za pomocą luminometru.

Test lucyferazy: wysokoprzepustowy test do pomiaru sygnałów luminescencyjnych przy użyciu zaprojektowanych bioreporterów opartych na systemie nanolucyferazy

Ten film demonstruje test komplementacji rozszczepionej lucyferazy w celu wykrycia interakcji białko-białko. W tym teście interesujące białka są oznaczane do małych i dużych fragmentów enzymu lucyferazy. Kiedy białka wchodzą w interakcję, duże i małe fragmenty łączą się, tworząc aktywny kompleks enzymatyczny, który w obecności określonego substratu uwalnia jasną luminescencję, którą można zmierzyć.

Test dzielonej komplementacji lucyferazy w celu identyfikacji specyficznych interakcji białko-białko

Prezentujemy szybką i tanią metodę przesiewową do identyfikacji regulatorów transkrypcji za pomocą wysokoprzepustowych transfekcji robotycznych i domowego testu lucyferazy o podwójnym świeceniu.  Protokół ten szybko generuje bezpośrednie dane funkcjonalne dla tysięcy genów i można go łatwo modyfikować w celu ukierunkowania na dowolny gen będący przedmiotem zainteresowania.

Wysokoprzepustowe funkcjonalne badania przesiewowe przy użyciu domowego testu lucyferazy o podwójnym blasku

Osiągnięcie zrozumienia procesów komórkowych na poziomie systemowym jest celem współczesnej biologii komórki. Opisujemy tutaj strategie multipleksowania reporterów lucyferazy różnych punktów końcowych funkcji komórkowych w celu zbadania funkcji genów przy użyciu bibliotek RNAi w skali genomu.

Multipleksowana platforma przesiewowa oparta na lucyferazie do badania transdukcji sygnału związanego z rakiem w hodowanych komórkach

Przedstawiono test bioluminescencji in vitro w celu określenia komórkowego rytmu dobowego w komórkach nabłonka sutka. Metoda ta wykorzystuje plazmidy reporterowe komórek ssaków eksprymujące zdestabilizowaną lucyferazy pod kontrolą promotora genu PERIOD 2. Można go dostosować do innych typów komórek w celu oceny specyficznego dla narządu wpływu na rytm okołodobowy.

In vitro Test bioluminescencji w celu scharakteryzowania rytmu okołodobowego w komórkach nabłonka sutka

Genetycznie kodowana lucyferazy jest popularnym nieinwazyjnym raportem ekspresji genów. Zastosowanie zautomatyzowanego rejestratora ALLIGATOR do obrazowania podłużnego lucyferazy pod kątem gazu i temperatury umożliwia rejestrację podłużną komórek bioluminescencyjnych w szerokim zakresie warunków. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób ALLIGATOR może być stosowany w kontekście badań nad rytmami okołodobowymi.

Elastyczny pomiar reporterów bioluminescencyjnych za pomocą zautomatyzowanego podłużnego obrazowania lucyferazy zoptymalizowanego pod kątem gazu i temperatury rejestratora (ALLIGATOR)

Neuronalne komórki macierzyste/progenitorowe wykazują różną dynamikę ekspresji komponentów sygnalizacyjnych Notch, które prowadzą do różnych wyników zdarzeń komórkowych. Taką dynamiczną ekspresję można ujawnić poprzez monitorowanie w czasie rzeczywistym, a nie przez analizę statyczną, przy użyciu bardzo czułego systemu obrazowania bioluminescencyjnego, który umożliwia wizualizację szybkich zmian w ekspresji genów.

Obrazowanie bioluminescencyjne w czasie rzeczywistym dynamiki sygnalizacji Notch podczas neurogenezy myszy

Opracowaliśmy test reporterowy biogenezy mikroRNA do wykorzystania w komórkach in vitro z czterema plazmidami: jeden z miRNA intronicznym, jeden z celem, jeden do nadekspresji białka regulatorowego i jeden dla lucyferazy Renilla. MiRNA zostało przetworzone i mogło kontrolować ekspresję lucyferazy poprzez wiązanie się z sekwencją docelową.

Test reporterowy do analizy dojrzewania intronowego mikroRNA w komórkach ssaków

Rytmy okołodobowe, które istnieją w większości organizmów, regulują czasową organizację organoidów biologicznych processes. 3D ostatnio pojawiły się jako fizjologicznie istotny model in vitro. Protokół ten opisuje zastosowanie bioluminescencyjnych reporterów do obserwacji rytmów okołodobowych w organoidach, umożliwiając badania in vitro rytmów okołodobowych w układach wielokomórkowych.

Monitorowanie oscylacji okołodobowych za pomocą reportera bioluminescencji w organoidach

Poznaj metodę badania biogenezy błony za pomocą testu genu reporterowego opartego na lucyferazie. Technika ta pozwala analizować ekspresję genów po fagocytozie w komórkach HEK293.

Badanie biogenezy błon za pomocą testu z genem reporterowym opartym na lucyferazie

Przeglądaj więcej filmów