Badanie biogenezy błony za pomocą testu genu reporterowego opartego na lucyferazie

Witam, jestem IL OV, aby badać koordynację różnych szlaków syntezy lipidów do zapamiętania i biogenezy. Przydatne jest posiadanie systemu eksperymentalnego, w którym biogeneza błony zachodzi szybko i indukuje. Odkryliśmy, że fagocytoza uderzeń lateksu jest szczególnie przydatna w takich badaniach, ponieważ komórki bardzo szybko syntetyzują nowe błony, aby uzupełnić te, które zostały utracone jako materiał owijający na początku procesu pochłaniania.

W tym filmie mój kolega Ong Zang zademonstruje, że procedury zostały wykorzystane do badania zmian w ekspresji genów wywołanych fagocytozą przy użyciu podejścia opartego na lucyferazie opartego na lucyferazy, gdzie, Cześć, jestem X z dźwigni eksonu północnego na Wydziale Biologii Molekularnej i Komórkowej na Uniwersytecie Harvarda. Dzisiaj pokażę Ci, jak wykorzystać raport genetyczny do analizy regulacji genów zaangażowanych w biogenezę błony po fagocytozie. Więc zacznijmy.

Do tej procedury wykorzystujemy hodowle ludzkiej nerki embrionalnej 2 93 komórek. Komórki te są hodowane w 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym na pożywce A, która składa się z bel zmodyfikowanych pożywki Eagles Egos lub DMM uzupełnionych 10% płodową surowicą B lub FBS i koktajlem antybiotyków. Stosując technikę standaryzacji, komórki są odłączane od dna naczynia, kontrowane, a następnie powlekane na 96-dołkowych płytkach pokrytych polilizyną, gdzie są hodowane przez 24 godziny, aż do rozpoczęcia transakcji.

W przypadku naszego transfektu rutynowo wykonujemy wszystkie warunki w trzech i transfekcie, w sumie od 50 do 100 i nanogramów plazmidowego DNA na studzienkę. Mieszanki w kratę powinny zawierać co najmniej konstrukt reporterowy wyrażający lucyferazy świetlika i plazmid kontrolny wyrażający lucyfery nerkowe z konstytutywnego promotora. Na początek przygotuj mieszaninę ramki surowicy i ramki antybiotykowej DM EM z odczynnikiem trans dwa N trzy transfekcji użyj 10 mikrolitrów DMM dla każdej studni, która ma być transfekowana i przy trzech mikrolitrach odczynnika trans 2 9 3 na mikrogram plazmidowego DNA.

Na przykład, jeśli 20 studzienek z każdej z nich ma być transfekowanych 50 nanogramami DNA w trzech mikrolitrach odczynnika trans 2 9 3 do 200 mikrolitrów DM EM. Roztwór miesza się przez wielokrotne pipetowanie w górę i w dół, a następnie pozostawia w spokoju w temperaturze pokojowej na co najmniej pięć minut. Następnie DNA jest umieszczane w oddzielnych mikroprobówkach wirówkowych. Stężenia naszych roztworów podstawowych z miernikiem dodatnim wynoszą zwykle od 10 do 100 nanogramów na mikrolitr.

Po inkubacji mieszaniny tranzytowej DM M przez pięć minut, przenosi się ją do probówki DNA, a roztwór ponownie miesza się przez pipetowanie. Następnie odstawiaj próbki w temperaturze pokojowej na 20 minut. Podczas 20-minutowej intubacji usunąć pożywkę z płytki do hodowli wstęgi 96 i zastąpić ją 19 mikrolitrami świeżej pożywki A po zakończeniu inkubacji w 10 mikrolitrach D-M-M-D-N-A przełożyć na trzy mieszaniny do każdego dołka.

Mieszaninę należy pipetować bezpośrednio do istniejącej cieczy. Nie pozwól, aby końcówka pipety dotykała ścianki probówki. Ważne jest również, aby uwzględnić trzy studzienki komórek, które nie zostaną poddane inspekcji.

Średnia aktywność lucyferazy w tych studzienkach zostanie później odjęta, gdy tło umieści 96-dołkową płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni C i hoduje komórki przez 24 godziny. Po zakończeniu 24-godzinnej inkubacji przystępujemy do indukowania biosyntezy błonowej, biozy luźnych kulek. Na początek przygotuj zawiesinę zawierającą pożywkę do hodowli komórkowych i luźny kulkę.

Aby to zrobić, przygotuj pożywkę B, która jest mieszanką jeden do jednego DM EM i konopi, pożywki F term plus antybiotyki i 10% FBS. Następnie na luźnych kulkach o grubości 0,75 mikrona w stężeniach do jednego miligrama na mililitr. Oczywiście każdy eksperyment powinien zawierać kontrole, w których nie dodaje się koralików.

Następnie usuń pożywkę z 96-dołkowej płytki hodowlanej i zastąp każdą studzienkę 100 mikrolitrami zawiesiny kulek. Po dodaniu zawiesiny wirować płytkę przez dwie minuty w temperaturze 1000 G. Pomaga to skoncentrować kulkę na dnie studzienki i ułatwia fagocytozę. Następnie chwyć komórki w temperaturze 37 stopni C przez sześć do 16 godzin.

W zależności od warunków i promotora użytego do napędzania wzrostu lucyferazy, ekspresję genu promotora można wykryć po jednej do trzech godzin. W przypadku niektórych eksperymentów może być konieczne odłączenie fal od syntezy lipidów, na przykład w celu zbadania wpływu niektórych leków na syntezę lipidów bez wpływu na cząsteczki w rządzie. W takich przypadkach inkubuj komórki z uderzeniem przez 30 do 16 minut, aby umożliwić komórkom cyto kulki.

Po tej inkubacji komórki są dwukrotnie myte PBS w celu usunięcia niewbudowanych kulek. Następnie dodaje się świeże podłoże, a następnie komórki inkubuje się przez sześć do 16 godzin w celu uzyskania ekspresji genów. Teraz jesteśmy gotowi do przystąpienia do testów na poziomie feralnym.

Aby rozpocząć testy Lucyfera, przygotuj bufor xis zawierający 20 milionów drzew trzonowych, HCL pH H 7,8, 10% objętości do objętości glicerolu i 0,5% objętości do objętości trytonu X 100 przed użyciem odpowiedniej ilości potrzebnej do eksperymentu. Następnie w ilości jednego mikrolitra na mililitr jednego molowego DTT. Nie używaj ponownie resztek roztworu DT T.

Następnie, w koktajlu inhibitorów proteazy do końcowego stężenia od 0,5 do jednego raza, przy pierwszym użyciu zestawu podwójnego żaru, przygotuj odczynnik Firefly Lucifers, przenosząc całą zawartość jednej butelki buforu lucyferów podwójnego blasku do jednej butelki substratu lucyferazy o podwójnym blasku. Podzielić niewykorzystany odczynnik lucyferazy na 10 milimetrów quas i przechowywać w temperaturze minus 20 stopni C. Gdy odczynnik lucyferazy będzie gotowy, wyjmij 96-dołkową płytkę z inkubatora do hodowli tkankowych i umieść ją na lodzie. Następnie usuń pożywkę przez aspirację, a następnie dodaj 40 mikrolitrów na studzienkę buforu do lizy i pozostaw płytkę na lodzie na 30 minut.

Następnie qua 15 mikrolitrów odczynnika Lucyfer na studzienkę. W białej, nieprzezroczystej płytce 96-dołkowej używamy płytki optycznej Perkin S 96. Następnie w 15 mikrolitrach komórki zjedz i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

Po 10 minutach odczytaj luminescencję w czytniku mikropłytek. Następnie wykonaj próbę lucyferów waniliowych, aby uzyskać dane dla plazmidu kontrolnego. Aby to zrobić, przygotuj się bezpośrednio przed, użyj odpowiedniej ilości roztworu substratu lucyferazy, dodając jedną część odczynnika podwójnego żarzenia, zatrzymania i żarzenia na 100 części.

Bufor podwójnej poświaty, zatrzymania i żarzenia. Następnie dodaj do każdego 15 mikrolitrów roztworu substratu. Dobrze inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie ponownie zmierz luminescencję.

Należy pamiętać, że zmodyfikowaliśmy zalecany przez producenta protokół dla tych testów z podwójnym żarzeniem. W celu zmniejszenia ilości odczynników wymaganych do pobrania próbki pro, teraz płytkę można ponownie przeanalizować za pomocą czytnika płytek. Po zebraniu danych za pomocą czytnika mikropłytek można je przenieść do arkusza kalkulacyjnego, takiego jak Microsoft Excel, w celu dalszej analizy.

Najpierw oblicz średnią z trzech niewyciętych studzienek i odejmij tę wartość od każdego z punktów danych. Następnie podziel dla każdej dobrze transfekowanej wartości lucyferazy świetlika. Kup to dla lucyferazy, a następnie oblicz dla każdego zestawu potrójnych próbek, oblicz średnią, a następnie odchylenie i współczynnik zmienności.

W naszym przykładzie używamy różnych koncentracji koralików, które zostały wykreślone na osi x w stosunku do stosunku aktywności świetlików do lukrów waniliowych. Jak widać, wzrost tego stosunku jest zależny od dawki. Właśnie pokazaliśmy, jak korzystać z raportu opartego na lucyferach, testu genetycznego do pomiaru ekspresji promotora receptora LDL w odpowiedzi na fagocytozę prędkości lateksu.

Wykonując tę procedurę, należy pamiętać, aby upewnić się, że komórki są tylko w 80 do 90% zlewające się w czasie transfekcji. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.