Badanie zachowań węchowych u dorosłych myszy

Układ węchowy gryzoni lub zmysł węchu stały się coraz popularniejszym obszarem badań. W celu przetestowania wrażliwości węchowej mysz poddaje się habituacji w klatce bez ściółki, a następnie wystawia na kawałki papieru filtracyjnego zawierające zwiększające się stężenia substancji zapachowej. Następnie rejestrowany jest czas, jaki mysz poświęca na badanie papieru filtracyjnego.

Test preferencji węchowych przeprowadza się w dokładnie taki sam sposób. Jednak zamiast zwiększać stężenia substancji zapachowych, odnotowuje się czas, jaki mysz spędza na badaniu różnych zapachów. Witam, nazywam się Rochelle Witt i pochodzę z laboratorium dr Rosalyn Siegel z Katedry Neurobiologii na Harvard Medical School.

Witam, nazywam się Jennifer Deno i również pracuję w laboratorium Siegel. Dzisiaj zaprezentujemy dwie procedury testowania węchu. Stosujemy te metody w naszym laboratorium do badania wrażliwości oraz preferencji węchowych.

Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć procedurę badania wrażliwości węchowej, należy przygotować cztery czyste klatki, w których nie ma ściółki. Klatki powinny mieć wymiary 8 cali wysokości, 10 cali szerokości i 18 cali długości.

Ustaw cztery klatki w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Następnie oddziel poszczególne areny za pomocą nieprzezroczystego papieru filtrowanego. Na koniec umieść czarny brystol na ostatniej przegrodzie w taki sposób, aby wyścielał on bok i dno klatki.

Oświetl arenę, przykrywając górną część klatki przezroczystym kawałkiem pleksiglasu. Następnie rozpocznij habituację badanych osobników. Umieść pierwszy osobnik w pierwszej klatce.

Po 15 minutach przenieś pierwszą osobnik do drugiej klatki. Oczyść pierwszą klatkę za pomocą Quatra side tb. Następnie umieść drugi osobnik w pierwszej, oczyszczonej klatce.

Kontynuuj ten proces z kolejnymi osobnikami przed rozpoczęciem testowania. Umieść jednego z osobników w czwartej klatce i poddaj go habituacji przez kolejne 15 minut. W rezultacie w każdej z trzech pierwszych klatek powinien znaleźć się zhabituowany osobnik.

Jesteśmy teraz gotowi do przygotowania próbek zapachowych. Próbki zapachowe powinny zostać przygotowane przez innego badacza, który nie zna tożsamości osobników, ich genotypów i/lub zastosowanych warunków. Rozpocznij przygotowanie próbek od wycięcia odpowiedniej liczby kwadratów z papieru filtracyjnego o wymiarach dwóch na dwie cale.

Następnie w probówkach stożkowych przygotuj odpowiednie rozcieńczenia wcześniej wybranego zapachu. Należy pamiętać, że różne tła genetyczne myszy mogą wymagać odmiennego rozcieńczenia zapachu w celu skutecznego rozróżnienia grupy kontrolnej i eksperymentalnej. W związku z tą obserwacją zalecamy empiryczne ustalenie odpowiednich rozcieńczeń zapachu na osobnikach podobnych do grupy kontrolnej przed przystąpieniem do testów eksperymentalnych z myszami naiwnymi. W przypadku próbek hydrofobowych, takich jak masło orzechowe, jako rozpuszczalnik należy zastosować olej; dla wszystkich pozostałych próbek użyj odpowiedniego rozpuszczalnika.

Użyj wirówki do wody destylowanej, aby upewnić się, że rozcieńczenia zostały odpowiednio wymieszane. Następnie ustaw urządzenie do cyfrowego zapisu wideo na dalnym końcu dygestorium w taki sposób, aby cały koniec klatki znajdował się w polu ostrości. Nagraj film próbny, aby upewnić się, że ustawienia kamery są odpowiednie.

W dzienniku laboratoryjnym zapisz kolejność, w jakiej będą testowane rozcieńczenia, dbając o to, aby kolejność ta w każdej próbie była randomizowana. Zapisz również numer miotu oraz numer identyfikacyjny osobnika. Gdy osobnik będzie już habituowany w arenie przez 15 minut, rozpocznij przygotowania do pierwszej próby.

Przenieś pierwszą rozcieńczenie do probówki stożkowej, kilkakrotnie aspirując i dyspensując ciecz, a następnie nanieś ją na kwadrat z papieru filtracyjnego. Powierzchnia papieru powinna być pokryta w około 85%. Użyj chusteczki typu Kim wipe, aby upewnić się, że papier filtracyjny nie jest nadmiernie nasycony.

Po przygotowaniu zapachowego papieru filtracyjnego możemy przystąpić do pierwszego testu wrażliwości węchowej. Aby rozpocząć test, należy uruchomić nagrywanie wideo. Następnie umieść zapachowy papier filtracyjny w klatce po przeciwnej stronie względem aktualnego położenia zwierzęcia.

Uruchom pomiar czasu. Po trzech minutach zatrzymaj nagrywanie i usuń zapach. Następnie ponownie uruchom stoper i przygotuj drugą próbkę zapachu.

Po jednej minucie rozpocznij nagrywanie wideo. Podobnie jak wcześniej, umieść próbkę zapachową w klatce po przeciwnej stronie niż aktualne położenie zwierzęcia. Powtórz tę procedurę dla każdego rozcieńczenia zapachu i dla każdego osobnika, pamiętając o zapisaniu numeru pliku wideo dla każdej próby.

Po zaprezentowaniu testu wrażliwości węchowej, należy przejść do testu preferencji węchowych. W przypadku testu preferencji węchowych należy postępować zgodnie z procedurą opisaną dla testu wrażliwości węchowej, z wyjątkiem dwóch niewielkich modyfikacji. Po pierwsze.

Zamiast przygotowywać wiele rozcieńczeń jednego, wcześniej wybranego zapachu, należy przygotować zarówno zapach atrakcyjny, jak i awersyjny. Po drugie, zamiast odnotowywać rozcieńczenie do przetestowania, należy zapisać kolejność testowanych wariantów, randomizując ją w każdej próbie. Wszystkie pozostałe kroki procedury są identyczne jak w przypadku testów węchowych, w tym habituacja badanych osobników, udział badacza pracującego w ślepej próbie, aplikacja zapachu na papier filtracyjny oraz czasowy zapis wideo każdej próby.

Po zakończeniu testów preferencji węchowych należy przystąpić do oceny wyników. Po zgromadzeniu wszystkich nagrań wideo z testów wrażliwości i preferencji węchowych, zmierz całkowity czas, jaki badany poświęcił na eksplorację każdego rozcieńczenia lub zapachu, aby zapewnić spójność danych. Do przeprowadzenia tej analizy należy wyznaczyć badacza pracującego w ślepym teście, który przeanalizuje nagrania wideo.

Wskazane jest, aby najpierw obejrzeć wstępnie wideo i odnotować następujące momenty: kiedy papier filtracyjny zostaje umieszczony w arenie, kiedy mysz zbliża się do papieru filtracyjnego, kiedy mysz bada papier filtracyjny oraz kiedy upłyną trzy minuty od momentu początkowego umieszczenia papieru filtracyjnego w arenie. Wiedza o tym, kiedy skupić się na zachowaniu myszy, ułatwia dokładną ocenę całkowitego czasu poświęconego na eksplorację podczas późniejszej analizy. Teraz obejrzyj całe nagranie. Użyj stopera, aby zmierzyć czas wszystkich prób badania w ciągu trzech minut od umieszczenia papieru filtracyjnego w arenie.

Czas badania definiuje się jako dowolny przedział czasowy, w którym nos myszy znajduje się w odległości mniejszej niż jeden milimetr od papieru filtracyjnego; ważne jest, aby nie uwzględniać czasu, w którym mysz znajduje się w bliskim sąsiedztwie papieru filtracyjnego, ale nie bada go aktywnie. W całkowitym czasie eksploracji nie należy uwzględniać epizodów gryzienia i lizania papieru, a także epizodów siedzenia na papierze. Należy ściśle i konsekwentnie przestrzegać tych zasad, aby dokładnie przeanalizować zachowania węchowe.

Po przejrzeniu nagrania wideo i odnotowaniu całkowitego czasu spędzonego na badaniu papieru filtracyjnego, powtórz analizę dla wszystkich filmów. Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki testów węchowych. Pierwszy wykres pokazuje wyniki sesji treningu wrażliwości węchowej.

Każda mysz z grupy eksperymentalnej B lub grupy kontrolnej A była eksponowana na jedno z pięciu różnych rozcieńczeń ekstraktu z cynamonu na papierze filtracyjnym podczas jednej trzyminuotowej sesji. Oceniono całkowity czas spędzony na eksploracji papieru filtracyjnego, a wykres ten przedstawia wyniki sesji testu preferencji węchowych. Każda mysz była eksponowana na każdy z różnych zapachów na papierze filtracyjnym podczas jednej trzyminuotowej sesji.

Oceniono całkowity czas spędzony na eksploracji papieru filtracyjnego. Właśnie pokazaliśmy, jak testować zdolności węchowe u dorosłych myszy; przy stosowaniu tych procedur ważne jest użycie myszy naiwnych, aby precyzyjnie badać zdolności węchowe, a nie inne funkcje, takie jak uczenie się i pamięć. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.