Badanie zachowań węchowych u dorosłych myszy

Układ węchowy szczura Rodin lub zmysł węchu stały się coraz popularniejszym obszarem badań. W celu przetestowania wrażliwości węchowej mysz poddawana jest habituacji w klatce bez ściółki, a następnie wystawia się ją na kawałki papieru filtracyjnego zawierające rosnące stężenia substancji zapachowej. Następnie rejestrowany jest czas, przez który mysz bada papier filtracyjny.

Testy preferencji węchowych przeprowadza się w dokładnie ten sam sposób. Jednak zamiast zwiększać stężenia substancji zapachowej, odnotowuje się czas, jaki mysz spędza na badaniu różnych zapachów. Witajcie, jestem Rochelle Witt z laboratorium dr Rosalyn Siegel z Katedry Neurobiologii na Harvard Medical School.

Witam, nazywam się Jennifer Deno i również pracuję w laboratorium Siegel. Dzisiaj zaprezentujemy dwie procedury testowania węchu. Stosujemy te procedury w naszym laboratorium do badania wrażliwości węchowej oraz preferencji zapachowych.

Zacznijmy. Aby rozpocząć procedurę testowania wrażliwości węchowej, przygotuj cztery czyste klatki, każda bez ściółki. Klatki powinny mieć wymiary 8 cali wysokości, 10 cali szerokości i 18 cali długości.

Ustaw cztery klatki w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Następnie oddziel poszczególne areny za pomocą nieprzezroczystego papieru filtracyjnego. Na koniec umieść czarną płytę z brystolu na ostatniej przegrodzie w taki sposób, aby wyłożyła ona bok i dno klatki.

Umożliwienie doświetlenia areny poprzez przykrycie góry klatki przezroczystym kawałkiem pleksiglasu. Następnie należy rozpocząć habituację osobników. Umieść pierwszy obiekt badawczy w pierwszej klatce.

Po 15 minutach przenieś pierwszą osobniczkę do drugiej klatki. Oczyść pierwszą klatkę za pomocą Quatra side tb. Następnie umieść drugą osobniczkę w pierwszej, oczyszczonej klatce.

Kontynuuj ten proces z kolejnymi osobnikami przed rozpoczęciem testowania. Umieść jednego z osobników w czwartej klatce i poddaj go habituacji przez kolejne 15 minut. Ostatecznie w każdej z trzech pierwszych klatek powinien znajdować się zahabituowany osobnik.

Jesteśmy teraz gotowi do przygotowania próbek zapachowych. Próbki zapachowe powinny być przygotowane przez innego badacza, który nie zna tożsamości osobników, ich genotypów oraz/lub zastosowanych warunków. Rozpocznij przygotowanie próbek od wycięcia odpowiedniej liczby kwadratów z papieru filtracyjnego o wymiarach dwóch na dwie cale.

Następnie przygotuj odpowiednie rozcieńczenia wcześniej wybranego zapachu w probówkach stożkowych. Należy pamiętać, że różne linie myszy mogą wymagać odmiennego rozcieńczenia zapachu w celu skutecznego odróżnienia grupy kontrolnej od eksperymentalnej. W związku z tą obserwacją pomocne jest empiryczne ustalenie odpowiednich rozcieńczeń zapachu na osobnikach podobnych do grupy kontrolnej przed przystąpieniem do testów eksperymentalnych z naiwnymi myszami. W przypadku próbek hydrofobowych, takich jak masło orzechowe, należy użyć oleju jako rozpuszczalnika; dla wszystkich pozostałych zastosuj odpowiedni rozpuszczalnik.

Użyj wortexa z wodą destylowaną, aby upewnić się, że rozcieńczenia zostały odpowiednio wymieszane. Następnie ustaw cyfrowe urządzenie do rejestracji wideo na przeciwległym końcu dygestorium w taki sposób, aby cały koniec klatki znajdował się w obszarze ostrości. Nagraj wstępne wideo, aby upewnić się, że ustawienia kamery są odpowiednie.

W zeszycie laboratoryjnym zapisz kolejność, w jakiej będą testowane rozcieńczenia, dbając o randomizację tej kolejności w każdej próbie. Zapisz również numer miotu oraz numery identyfikacyjne badanego osobnika. Po 15-minutowej habituacji osobnika w arenie rozpocznij przygotowania do pierwszej próby.

Przenieś pierwsze rozcieńczenie do probówki stożkowej, mieszając je poprzez kilkukrotne zasysanie i wydmuchanie cieczy pipetą, a następnie nanieś na kwadrat papieru filtracyjnego. Powierzchnia papieru filtracyjnego powinna być pokryta optymalnie w około 85%. Użyj chusteczki Kim wipe, aby upewnić się, że papier filtracyjny nie jest nadmiernie nasycony.

Po przygotowaniu zapachowego papieru filtracyjnego można przystąpić do pierwszego testu wrażliwości węchowej. Aby rozpocząć próbę, należy włączyć nagrywanie wideo. Następnie umieść zapachowy papier filtracyjny w klatce po przeciwnej stronie niż aktualne położenie zwierzęcia.

Rozpocząć pomiar czasu. Po trzech minutach zatrzymać nagrywanie i usunąć zapach. Następnie ponownie uruchomić stoper i przygotować drugą próbkę zapachową.

Po jednej minucie rozpocznij nagrywanie wideo. Podobnie jak poprzednio, umieść próbkę zapachu w klatce po przeciwnej stronie aktualnej pozycji zwierzęcia. Powtórz tę procedurę dla każdego rozcieńczenia zapachu i dla każdego osobnika, pamiętając o zapisaniu numeru pliku wideo dla każdej próby.

Po zaprezentowaniu testu wrażliwości węchowej, można przejść do testu preferencji węchowych. W celu przeprowadzenia testu preferencji węchowych należy postępować zgodnie z procedurą opisaną dla testu wrażliwości węchowej, z wyjątkiem dwóch niewielkich modyfikacji. Po pierwsze.

Zamiast przygotowywać wiele rozcieńczeń jednego preselekcjonowanego zapachu, należy przygotować zarówno zapach atrakcyjny, jak i awersyjny. Po drugie, zamiast zapisywać rozcieńczenie do przetestowania, należy zapisać kolejność zmiennych, które zostaną przetestowane, randomizując tę kolejność w każdym badaniu. Wszystkie pozostałe kroki procedury są identyczne z badaniem węchowym, w tym habituacja badanych osobników, udział ślepego badacza, nakładanie zapachu na papier filtracyjny oraz pomiar czasu nagrania wideo każdego badania.

Po zakończeniu testów preferencji węchowych należy przystąpić do oceny wyników. Po zebraniu wszystkich nagrań wideo z testów wrażliwości i preferencji węchowych, należy zmierzyć całkowity czas, jaki badany spędził na eksploracji każdego rozcieńczenia lub zapachu w celu zapewnienia spójności. Analizę nagrań wideo powinien przeprowadzić badacz pracujący w ślepej próbie.

Warto najpierw przejrzeć wideo i odnotować następujące momenty: umieszczenie papieru filtracyjnego w arenie, moment, w którym mysz zbliża się do papieru filtracyjnego, moment, w którym mysz bada papier filtracyjny oraz moment, w którym od czasu początkowego umieszczenia papieru w arenie upłynęły trzy minuty. Wiedza o tym, kiedy skupić się na zachowaniu myszy, ułatwia dokładną ocenę całkowitego czasu poświęconego na eksplorację podczas analizy. Teraz przejrzyj całe wideo. Użyj stopera, aby zmierzyć czas wszystkich interakcji badawczych w ciągu trzech minut od umieszczenia papieru filtracyjnego w arenie.

Czas badania definiuje się jako każdy przedział czasu, w którym nos myszy znajduje się w odległości mniejszej niż 1 mm od papieru filtracyjnego; ważne jest, aby nie uwzględniać czasu, w którym mysz znajduje się w bliskim sąsiedztwie papieru filtracyjnego, ale nie bada go aktywnie. W całkowitym czasie eksploracji nie należy uwzględniać epizodów gryzienia i lizania papieru, a także epizodów siedzenia na papierze. Należy ściśle i konsekwentnie przestrzegać tych zasad, aby dokładnie przeanalizować zachowanie węchowe.

Po przejrzeniu nagrania wideo w celu ustalenia całkowitego czasu spędzonego na badaniu papieru filtracyjnego, należy powtórzyć analizę dla wszystkich filmów. Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki testów węchowych. Pierwszy wykres prezentuje wyniki sesji treningu wrażliwości węchowej.

Każda mysz z grupy eksperymentalnej B lub grupy kontrolnej A była eksponowana na jedno z pięciu różnych rozcieńczeń ekstraktu cynamonowego na papierze filtracyjnym podczas jednej trzy minutowej sesji. Oceniono całkowity czas spędzony na badaniu papieru filtracyjnego, a wykres ten przedstawia wyniki sesji testu preferencji węchowych. Każda mysz była eksponowana na każdy z różnych zapachów na papierze filtracyjnym podczas jednej trzy minutowej sesji.

Oceniono całkowity czas spędzony na eksploracji papieru filtracyjnego. Właśnie pokazaliśmy, jak testować zdolności węchowe u dorosłych myszy; stosując te procedury, ważne jest użycie myszy naiwnych, aby dokładnie zbadać zdolności węchowe, a nie inne umiejętności, takie jak uczenie się i pamięć. To wszystko.

Dziękujemy za obejrzenie materiału i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu doświadczeń.