Name: in vivo Imagem de cálcio da resposta dos neurônios dos gânglios da raiz dorsal a estímulos somáticos e viscerais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: Aprenda imagem de cálcio in vivo em neurônios do gânglio da raiz dorsal lombar-6 de camundongos para estudar respostas a estímulos somáticos e viscerais. Este método avança a compreensão dos mecanismos da dor visceral e dos efeitos analgésicos da acupuntura.

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Este estudo foi financiado pelo Programa Nacional de P&D da China (nº 2022YFC3500702), pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 82230123, 82174281).

Este protocolo animal foi aprovado pelos Comitês de Ética em Cuidados e Uso de Animais do Instituto de Acupuntura e Moxabustão, Academia Chinesa de Ciências Médicas Chinesas, e cumpriu o Guia dos Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais Experimentais para garantir o mínimo de uso e desconforto dos animais. Os camundongos Pirt-cre foram gentilmente doados pelo Dr. Xinzhong Dong, da Universidade Johns Hopkins (Baltimore, MD). Os camundongos Rosa26-loxP-STOP-loxP-GCaMP6s foram obtidos de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais). O procedimento a seguir é otimizado para ambos os sexos de camundongos pesando 20-35 g. A idade recomendada para camundongos submetidos à operação foi entre 8 e 14 semanas. Indicadores de cálcio geneticamente codificados (GECIs), como camundongos Pirt-GCaMP6s, ou camundongos C57 normais injetados intratecalmente com GECIs virais, foram adotados para mostrar as principais populações de neurônios DRG. Camundongos geneticamente modificados injetados por via intratecal com GECIs virais ou cruzados com camundongos Rosa26-GCaMP mostrariam a população específica de neurônios DRG. Batas de laboratório, luvas e máscaras foram usadas durante todo o protocolo. Após o experimento, os camundongos foram eutanasiados com inalação de CO2 seguida de luxação cervical.
1. Configuração pré-operatória
<ol>
	<li>Verifique se o dispositivo de ventilação anestésica (consulte a Tabela de Materiais) foi instalado corretamente.</li>
	<li>Certifique-se de que o sistema de imagem (consulte Tabela de materiais) foi pré-aberto e está funcionando corretamente. 
	NOTA: A operação e os procedimentos de imagem foram realizados sequencialmente, enquanto o processo de análise pode ser concluído offline posteriormente.</li>
</ol>
2. Anestesia
<ol>
	<li>Injectar intraperitonealmente no ratinho uma solução de tribromoetanol (1,25%, 250 mg/kg, ver Tabela de Materiais)13,14,15. Avalie a profundidade da anestesia por pinça do dedo do pé antes de prosseguir.</li>
	<li>Raspe o cabelo na região lombar e na parte cervical ventral.</li>
	<li>Coloque o mouse em decúbito dorsal na almofada de aquecimento (consulte a Tabela de Materiais).</li>
	<li>Aplique pomada nos olhos do animal para evitar que eles sequem. 
	NOTA: A profundidade da anestesia foi mantida enquanto o camundongo não mostrou resposta a uma pinça da pata traseira durante todos os procedimentos cirúrgicos e de gravação. Se o animal apresentasse algum sinal de dor, um adicional de 0,2 mL de solução de tribromoetanol foi administrado por via intraperitoneal, ou isoflurano a 0,5% foi administrado por via intratraqueal após a aplicação do ventilador para evitar espasmos musculares e garantir a profundidade da anestesia.</li>
</ol>
3. Traqueotomia
<ol>
	<li>Faça uma incisão na linha média de aproximadamente 2 cm na pele da garganta, usando uma lâmina cirúrgica, do esterno ao queixo.</li>
	<li>Estenda a incisão e afaste suavemente as glândulas submaxilares, garantindo a exposição total dos músculos digástricos localizados abaixo das glândulas, correndo longitudinalmente ao longo do meio da traqueia.</li>
	<li>Uma vez que a costura da musculatura paratraqueal no meio dos músculos é vista, exponha a traqueia separando suavemente a musculatura e retraindo-a.</li>
	<li>Crie uma incisão transversal na traqueia, grande o suficiente para acomodar a cânula da traqueia (diâmetro externo de 1,3 mm, comprimento de 13 mm, com um adaptador em Y, consulte a Tabela de Materiais) direcionada para o pulmão (Figura 1A).</li>
	<li>Cubra a traqueia com os músculos paratraqueais e as glândulas submaxilares e, em seguida, suture os tecidos circundantes na pele camada por camada usando suturas cirúrgicas 5-0.</li>
</ol>
4. Exposição das vértebras lombares
<ol>
	<li>Coloque o animal em uma posição de bruços na almofada de aquecimento.</li>
	<li>Crie uma incisão na linha média de aproximadamente 7 cm na parte inferior das costas, estendendo-se da vértebra lombar-5 à vértebra sacral-1.</li>
	<li>Exponha cuidadosamente os processos espinhosos das três vértebras, afastando os músculos longuíssimo lombar.</li>
	<li>Exponha os três processos articulares e processos mamilares sucessivos, com o segmento de registro no meio das vértebras, afastando as partes internas do longuíssimo lombar bilateral, músculos dorsais da coluna cervical e músculos dorsais da semicoluna cervical (Figura 1B). 
	NOTA: Os processos articulares e mamilares das três vértebras foram expostos para permitir que a pinça espinhal prendesse o animal sem deslocamento durante o registro.</li>
</ol>
5. Exposição do gânglio da raiz dorsal
<ol>
	<li>Imobilize com segurança o animal com uma pinça dentada (ver Tabela de Materiais) nos processos articulares bilaterais das vértebras vizinhas. Em seguida, use uma pinça rongeur para remover os processos articulares e mamilares esquerdo ou direito das vértebras lombares-6.</li>
	<li>Exponha cuidadosamente o DRG lombar-6 esquerdo ou direito depois de limpar os tecidos conjuntivos acima dele, mantendo o epineuro intacto no lado esquerdo ou direito das vértebras lombares-6.</li>
	<li>Garantir as condições ativas do DRG exposto cobrindo as áreas expostas com pequenas bolas de algodão embebidas em soro fisiológico. 
	NOTA: Troque as bolas de algodão até que não haja vazamento sutil de sangue perto do DRG exposto e do tecido circundante, pois isso pode afetar a imagem clara dos neurônios DRG. Substitua as pequenas bolas de algodão molhadas com solução salina até que não haja vazamento vermelho ou amarelo de fluidos teciduais.</li>
</ol>
6. Imobilização e ventilação
<ol>
	<li>Coloque o animal com o DRG lombar-6 exposto em uma almofada de aquecimento no palco de uma pinça espinhal personalizada16,17 (Figura 1C).</li>
	<li>Prenda o animal usando dois grampos nas colunas vertebrais das vértebras vizinhas para minimizar o movimento durante o teste (Figura 1D).</li>
	<li>Continue a trocar as bolas de algodão umedecidas com solução salina até que a área cirúrgica esteja suficientemente limpa (Figura 1E).</li>
	<li>Monitore a ventilação e a oximetria de pulso durante todo o experimento. 
	NOTA: Imobilize as colunas vertebrais usando o grampo espinhal personalizado e, em seguida, ajuste o ângulo da almofada para que a objetiva do microscópio fique perpendicular ao DRG. Faça os ajustes necessários para alinhar a objetiva e o DRG usando ajustadores de ângulo.</li>
</ol>
7. Configuração de hardware e software para imagens
<ol>
	<li>Insira o grampo espinhal personalizado no estágio de microscópio personalizado (Figura 1F,G).</li>
	<li>Posicione uma lente objetiva aérea de longa distância de trabalho de 10x/0,32 de um microscópio confocal (consulte a Tabela de Materiais) sobre o DRG exposto para geração de imagens (Figura 1G).</li>
	<li>Capture pilhas z de lapso de tempo do DRG L-6 intacto com uma resolução de 25 μm/passo e 512 x 512 ou 1024 x 1024 pixels. A duração de uma varredura de pilha de todo o DRG varia de 5 a 15 s com base em fatores como a perpendicularidade da posição do DRG em relação à lente objetiva, a profundidade e a velocidade de cada etapa de varredura e a resolução da imagem.</li>
	<li>Realize a varredura XYZT do DRG com 4-8 pilhas, que incluem 1-3 estados basais, 2-3 estímulos de acupuntura ou distensão colorretal visceral (CRD) e 1-2 estados pós-estímulos.</li>
</ol>
8. Acupuntura/estímulos viscerais e imagem
<ol>
	<li>Aplique estímulos de escovação ou pinçamento nas áreas da parte inferior das costas, membros posteriores ou patas traseiras do animal para avaliar o campo receptivo mais sensível dos neurônios DRG imageados (Figura 1H).</li>
	<li>Administre estímulos de acupuntura manualmente ou com um estimulador de ponto de acupuntura e nervo disponível comercialmente (Figura 1F) (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Induza estímulos viscerais usando distensão colorretal (CRD) com um manômetro de ar de fabricação própria (Figura 1H). 
	NOTA: Teste o campo receptivo mais sensível dos neurônios DRG imageados escovando ou beliscando as áreas receptivas do DRG lombar-6. Se esses estímulos causarem alterações de fluorescência durante a gravação da pilha XYZT, selecione pontos de acupuntura nessas áreas, como o ponto de acupuntura lombar BL25 (Dachangshu)18. Escolha pontos de acupuntura (como mostrado em Figura 2) que tenham a pele e o músculo dentro do campo receptivo da inervação lombar-6.</li>
</ol>
9. Análise e processamento de dados
<ol>
	<li>Avalie as respostas evocadas de cálcio usando um microscópio confocal, medindo o aumento da fluorescência verde do GCaMP neuronal ao se ligar ao cálcio intracelular após estímulos somáticos ou viscerais.</li>
	<li>Rastreie manualmente as células visíveis e determine o tamanho da célula e a intensidade relativa da fluorescência usando o software de imagem (Fiji, consulte a Tabela de Materiais). Defina neurônios pequenos, médios e grandes como tendo diâmetros de soma de <20 μm, 20 a 30 μm e >30 μm, respectivamente, com base em estudos anteriores17,19.</li>
	<li>Exprime a intensidade de fluorescência como uma razão entre o aumento da fluorescência evocada máxima e o nível basal (ΔF/F0) ou uma razão entre a fluorescência evocada máxima e o nível basal (Ft/F0), em que F0 representa a intensidade máxima de fluorescência medida durante o período basal.</li>
	<li>Meça a porcentagem de neurônios ativados e a intensidade dos transientes evocados de cálcio para avaliar as mudanças na capacidade de resposta neuronal após estímulos somáticos ou CRD.</li>
	<li>Defina a ativação de uma célula como um aumento na intensidade de fluorescência (ΔF) ≥30% da linha de base (F0). 
	NOTA: Antes de traçar células visíveis, ajuste o brilho das imagens para o nível máximo para ajudar na identificação das bordas das células. Não trace células se houver alguma incerteza. Revise o filme gravado para frente e para trás para garantir que nenhuma célula seja esquecida.</li>
</ol>

Advanced Imaging of Dorsal Root Ganglion Neurons for Sensory Modality Research

<ol><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+tactile+acuity+in+chronic+low+back+pain+is+linked+with+structural+neuroplasticity+in+primary+somatosensory+cortex+and+is+modulated+by+acupuncture+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Reduced tactile acuity in chronic low back pain is linked with structural neuroplasticity in primary somatosensory cortex and is modulated by acupuncture therapy.</a> Neuroimage. 217, 116899(2020).</li>
<li>Wei, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroacupuncture+activates+inhibitory+neural+circuits+in+the+somatosensory+cortex+to+relieve+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Electroacupuncture activates inhibitory neural circuits in the somatosensory cortex to relieve neuropathic pain.</a> iScience. 24 (2), 102066(2021).</li>
<li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Referred+somatic+hyperalgesia+mediates+cardiac+regulation+by+the+activation+of+sympathetic+nerves+in+a+rat+model+of+myocardial+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Referred somatic hyperalgesia mediates cardiac regulation by the activation of sympathetic nerves in a rat model of myocardial ischemia.</a> Neuroscience Bulletin. 38 (4), 386-402 (2022).</li>
<li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+hypersensitivity+as+an+indicator+of+visceral+inflammation+via+c-nociceptor+axon+bifurcation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Cutaneous hypersensitivity as an indicator of visceral inflammation via c-nociceptor axon bifurcation.</a> Neuroscience Bulletin. 37 (1), 45-54 (2021).</li>
<li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+in+population+of+dorsal+root+ganglion+neurons+unravels+novel+mechanisms+of+visceral+pain+sensitization+and+referred+somatic+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging in population of dorsal root ganglion neurons unravels novel mechanisms of visceral pain sensitization and referred somatic hypersensitivity.</a> Pain. 162 (4), 106801081(2021).</li>
<li>Huang, T. Y., Belzer V Fau - Hanani, M., Hanani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+in+dorsal+root+ganglia%3A+possible+contribution+to+visceral+pain%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Gap junctions in dorsal root ganglia: possible contribution to visceral pain.</a> European Journal of Pain. 14 (1), 49.e1-49.e11 (2010).</li>
<li>Wang, Y. L., Su, Y. S., He, W., Jing, X. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroacupuncture+relieved+visceral+and+referred+hindpaw+hypersensitivity+in+colitis+rats+by+inhibiting+tyrosine+hydroxylase+expression+in+the+sixth+lumbar+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropeptides%22%5BJournal%5D)">Electroacupuncture relieved visceral and referred hindpaw hypersensitivity in colitis rats by inhibiting tyrosine hydroxylase expression in the sixth lumbar dorsal root ganglia.</a> Neuropeptides. 77, 101957(2019).</li>
<li>Weng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroacupuncture+diminishes+P2X2+and+P2X3+purinergic+receptor+expression+in+dorsal+root+ganglia+of+rats+with+visceral+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">Electroacupuncture diminishes P2X2 and P2X3 purinergic receptor expression in dorsal root ganglia of rats with visceral hypersensitivity.</a> Neural Regeneration Research. 8 (9), 802-808 (2013).</li>
<li>Spencer, N. J., Hibberd, T. J., Lagerström, M., Otsuka, Y., Kelley, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visceral+pain+-+Novel+approaches+for+optogenetic+control+of+spinal+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Visceral pain - Novel approaches for optogenetic control of spinal afferents.</a> Brain Research. 1693 (Pt B), 159-164 (2018).</li>
<li>Mao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+in+vivo+single-fiber+recording+and+intact+dorsal+root+ganglion+with+attached+sciatic+nerve+to+examine+the+mechanism+of+conduction+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Use of in vivo single-fiber recording and intact dorsal root ganglion with attached sciatic nerve to examine the mechanism of conduction failure.</a> Journal of Visualized Experiments. 150, e59234(2019).</li>
<li>Ma, C., Nie, H., Gu, Q., Sikand, P., Lamotte, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+responses+of+cutaneous+C-mechanosensitive+neurons+in+mouse+to+punctate+chemical+stimuli+that+elicit+itch+and+nociceptive+sensations+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">In vivo responses of cutaneous C-mechanosensitive neurons in mouse to punctate chemical stimuli that elicit itch and nociceptive sensations in humans.</a> Journal of Neurophysiology. 107 (1), 357-363 (2012).</li>
<li>Anderson, M., Zheng, Q., Dong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+pain+mechanisms+by+calcium+imaging+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Investigation of pain mechanisms by calcium imaging approaches.</a> Neuroscience Bulletin. 34 (1), 194-199 (2018).</li>
<li>Yao, L., Ye, Q., Liu, Y., Yao, S., Yuan, S., Xu, Q., Deng, B., Tang, X., Shi, J., Luo, J., Wu, J., Wu, Z., Liu, J., Tang, C., Wang, L., Xu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroacupuncture+improves+swallowing+function+in+a+post-stroke+dysphagia+mouse+model+by+activating+the+motor+cortex+inputs+to+the+nucleus+tractus+solitarii+through+the+parabrachial+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Electroacupuncture improves swallowing function in a post-stroke dysphagia mouse model by activating the motor cortex inputs to the nucleus tractus solitarii through the parabrachial nuclei.</a> Nat Commun. 14 (1), 810 PMID: 36781899; PMCID: PMC9925820 (2023).</li>
<li>Tian, D., Liu, B., Huang, S., Shi, W., Tian, Y., Yang, Y., Zhang, D., Zhang, Z., Bu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postoperative+Ileus+Murine+Model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Postoperative Ileus Murine Model.</a> J Vis Exp. (209), PMID: 39072642 (2024).</li>
<li>Zhu, X., Li, C., Afridi, S. K., Zu, S., Xu, J. W., Quanquin, N., Yang, H., Cheng, G., Xu, Z. E90 subunit vaccine protects mice from Zika virus infection and microcephaly. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhu%2C+X+%22Acta+Neuropathol+Commun%22">Acta Neuropathol Commun</a>. 6 (1), 77 PMID: 30097059; PMCID: PMC6086021 (2018).</li>
<li>Zheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronized+cluster+firing%2C+a+distinct+form+of+sensory+neuron+activation%2C+drives+spontaneous+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synchronized cluster firing, a distinct form of sensory neuron activation, drives spontaneous pain.</a> Neuron. 110 (2), 209-220 (2022).</li>
<li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+activation+of+primary+sensory+neurons+contributes+to+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain.</a> Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2Y12+receptor+as+a+new+target+for+electroacupuncture+relieving+comorbidity+of+visceral+pain+and+depression+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Medicine%22%5BJournal%5D)">P2Y12 receptor as a new target for electroacupuncture relieving comorbidity of visceral pain and depression of inflammatory bowel disease.</a> Chinese Medicine. 16 (1), 139(2021).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+neuron-specific+GPCR+Mrgprs+are+itch+receptors+mediating+chloroquine-induced+pruritus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sensory neuron-specific GPCR Mrgprs are itch receptors mediating chloroquine-induced pruritus.</a> Cell. 139 (7), 1353-1365 (2009).</li>
<li>Chen, G. S., Su, X. L., Liu, Q., Wei, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+progress+of+moxibustion+in+treatment+of+irritable+bowel+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Acupuncture-Moxibustion%22%5BJournal%5D)">Research progress of moxibustion in treatment of irritable bowel syndrome.</a> World Journal of Acupuncture-Moxibustion. 31 (02), 136-140 (2021).</li>
<li>Scanziani, M., MHäusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiology+in+the+age+of+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461 (7266), 930-939 (2009).</li>
<li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top-down+descending+facilitation+of+spinal+sensory+excitatory+transmission+from+the+anterior+cingulate+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Top-down descending facilitation of spinal sensory excitatory transmission from the anterior cingulate cortex.</a> Nature Communications. 9 (1), 1886(2018).</li>
<li>Cartarozzi, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+of+motoneurons+and+adjacent+glia+in+the+ventral+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging of motoneurons and adjacent glia in the ventral spinal cord.</a> Journal of Neuroscience Methods. 299, 8-15 (2018).</li>
<li>Shannonhouse, J., Gomez, R., Son, H., Zhang, Y., Kim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+calcium+imaging+of+neuronal+ensembles+in+networks+of+primary+sensory+neurons+in+intact+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia.</a> Journal of Visualized Experiments. 192, e64826(2023).</li>
<li>Davalos, D., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. 59, e2760(2012).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+imaging+of+dorsal+root+ganglia+in+awake+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Long-term imaging of dorsal root ganglia in awake behaving mice.</a> Nature Communications. 10 (1), 3087(2019).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Acredita-se que a analgesia por acupuntura seja modulada por processos integrativos no GRD, envolvendo uma interação entre impulsos aferentes das regiões dolorosas e impulsos dos pontos de acupuntura. Aqui, descrevemos um procedimento elaborado para imagens L6 DRG. As vantagens da imagem são múltiplas, incluindo resolução espacial notável, a possibilidade de imagens de alta eficiência de grandes áreas de neurônios simultaneamente e a capacidade de monitorar subtipos celulares específicos e domínios subcelulares usando sondas de direcionamento de genes21. Na medula espinhal, múltiplas técnicas de laminectomia foram desenvolvidas para imagens in vivo da atividade dos neurônios espinhais22,23. Embora o DRG esteja nas proximidades da medula espinhal, a imagem in vivo das células DRG permanece mais desafiadora devido à sua localização cercada por tecido conjuntivo e músculos. Um estudo anterior mostrou uma abordagem para pesquisar as respostas neurais de L5 DRG sob estímulos somáticos24. Como os neurônios L5 DRG recebem principalmente aferências somáticas em vez de aferentes viscerais, permanecem dúvidas sobre procedimentos cirúrgicos para pesquisar a atividade dos neurônios DRG que recebem informações somáticas e viscerais.
O método descrito aqui permite imagens de cálcio estáveis em neurônios geneticamente definidos do DRG enquanto aplica estimulação de acupuntura e estimulação visceral em camundongos intactos. Como é mencionado na maioria das técnicas in vivo , a estabilidade de imagem alcançável depende fortemente do dispositivo de estabilização da coluna vertebral e da anestesia adequada25. Neste estudo, um adaptador espinhal personalizado equipado com ajustadores de ângulo foi usado para inclinar convenientemente a coluna vertebral para obter imagens nítidas do DRG. Um par de pinças Adson foi modificado para servir como pinças de vértebras espinhais presas a braços articulados, permitindo espaço suficiente para abaixar uma lente de ar sobre o DRG exposto. Pinças alternativas podem ser aplicadas conforme necessário para diferentes segmentos da medula espinhal para oferecer melhor estabilidade. É aconselhável suspender ligeiramente a medula espinhal e seu campo de imagem das pinças, o que também reduz o deslocamento respiratório. Outra estratégia importante para minimizar as flutuações durante a imagem é o uso de cânula traqueal, anestesia e relaxantes musculares combinados com ventilação mecânica.
Este estudo também pode ser adaptado para imagens de dois fótons, o que pode fornecer melhor resolução celular em tecidos mais profundos. Recentemente, Chen et al. desenvolveram uma técnica de imagem que permite aos pesquisadores examinar a atividade dos neurônios no DRG de camundongos acordados por longos períodos26. No entanto, ainda não está prontamente disponível para a maioria dos laboratórios devido à dificuldade no preparo cirúrgico. Além disso, embora o método descrito aqui não seja adequado para imagens de DRG ao longo de semanas em camundongos acordados, ele apresenta vantagens na aplicação de drogas e estimulação da raiz dorsal, uma vez que a pele do animal pode ser costurada a um anel para segurar uma piscina para perfusão de ACSF.
Existem também algumas limitações para este protocolo. Restringir o registro aos segmentos da raiz dorsal lombar limita a aplicabilidade dessa técnica a vários segmentos ganglionares que inervam diferentes órgãos em todo o corpo, como para o estudo de órgãos torácicos por meio do registro de DRGs torácicos. Os vídeos de imagem de cálcio foram analisados usando o software de imagem. Existem desafios na análise de dados de imagem de cálcio, como detecção de células e extração de sinal de Ca2+ . Scripts escritos sob medida no MATLAB parecem ser uma ferramenta eficaz, mas exigem que o pesquisador tenha experiência em programação.

<a href="https://app.jove.com/t/6596">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/65975">10.3791/65975</a>

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Erratum: In Vivo Calcium Imaging of Dorsal Root Ganglia Neurons' Response to Somatic and Visceral Stimuli

A acupuntura, parte integrante da medicina tradicional chinesa, ganhou reconhecimento global principalmente por sua eficácia no controle da dor, incluindo o alívio da dor visceral crônica1. Nas últimas décadas, nosso conhecimento dos mecanismos nervosos centrais subjacentes à analgesia por acupuntura sofreu um crescimento considerável1,2. No entanto, pouca atenção tem sido dada à exploração dos papéis funcionais dos neurônios dos gânglios da raiz dorsal (DRG) na indução do efeito analgésico da acupuntura na nocicepção visceral. Estudos analgésicos de nocicepção visceral e acupuntura são potencialmente realizados em neurônios sensoriais primários usando técnicas eletrofisiológicas ou outros métodos de registro neural3,4. Essa pesquisa ajuda a compreender a relação entre a entrada somática e visceral de tecidos-alvo específicos ou órgãos-alvo, oferecendo informações valiosas sobre condições relacionadas à acupuntura, dor visceral, regulação do sistema nervoso autônomo e condições médicas relacionadas.
Sendo os neurônios de primeira ordem no sistema somatossensorial, os neurônios no DRG são chamados de neurônios sensoriais primários que têm papéis importantes na transdução de informações sobre o ambiente externo, bem como o estado interno, em sinais elétricos e na transmissão de sinais para o sistema nervoso central (SNC). Numerosos estudos sugeriram que a nocicepção visceral foi predominantemente retransmitida por neurônios sensoriais cujos corpos celulares estão na classe DRG<sup='xref'>5,6. Embora inúmeras pesquisas tenham elucidado o mecanismo celular e molecular dos neurônios DRG no efeito analgésico induzido pela acupuntura na dor visceral7,8, existe muito pouca literatura sobre suas características funcionais devido a dificuldades técnicas9. Vários métodos para registrar a atividade neural no DRG, como registro de fibra periférica, registro de eletrofisiologia de célula única e imagem de cálcio in vivo, podem ser usados para registrar os padrões e propriedades dos potenciais de ação transmitidos ao longo dos axônios10. O registro do DRG com eletrodos de vidro frouxamente remendados tem sido uma das técnicas mais amplamente utilizadas para investigar a correlação entre atividades neuronais e diferentes estímulos in vivo11. No entanto, os métodos tradicionais, como o registro eletrofisiológico, não podem examinar com eficiência números de células suficientes e subtipos celulares específicos distintos para identificar neurônios responsivos a viscerais in vivo.
Além de codificar a sensação periférica, os neurônios DRG desempenham um papel significativo na transmissão de sinais de acupuntura para o sistema nervoso central. O registro eletrofisiológico tradicional já foi amplamente aplicado para explorar a regulação da acupuntura em atividades anormais de neurônios DRG induzidas por dor patológica11. Segmentos apropriados de DRG precisam ser observados em relação à inervação sensorial. O DRG lombar (L) 6 foi geralmente observado para investigar a modulação do cólon4.
Avanços recentes no desenvolvimento de métodos ópticos e genéticos tornam possível investigar a atividade de grandes populações de neurônios geneticamente marcados simultaneamente12. No entanto, ainda faltam métodos detalhados de imagem de cálcio para monitorar a atividade neuronal no DRG sob estimulação visceral e somática. Portanto, este protocolo explica os procedimentos para observação in vivo da capacidade de resposta dos neurônios L6 DRG à estimulação intracolônica e acupuntura. O método descrito aqui também pode ser usado para detectar características de neurônios sensoriais somáticos e viscerais.
A ampla aplicação e promoção da imagem de cálcio oferece uma ferramenta muito eficaz e prática para a pesquisa de acupuntura. Considerando as vantagens da imagem de cálcio mencionadas acima, esse método deveria ter sido difundido e aplicado na pesquisa de acupuntura. No entanto, a utilização de imagens de cálcio na pesquisa de acupuntura ainda é relativamente incomum. A principal razão para essa limitação pode ser a dificuldade de procedimentos operacionais e de registro. O objetivo principal deste artigo é fornecer uma visão geral de alguns pontos críticos na condução de registros de imagens de cálcio de neurônios L6 DRG em camundongos. Mais importante ainda, esperamos promover o avanço e o desenvolvimento da pesquisa em acupuntura usando esta ferramenta de ponta in vivo.

<table><tbody><tr><td>Sistema de Anestesia</td>Microscópio Confocal <td>Kent Scientific</td><td>SomnoSuite</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>STELLARIS 8</td><td></td></tr><tr><td>DC Controlador de Temperatura</td><td>FHC</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>DC Controlador de Temperatura Almofada de Aquecimento</td><td>FHC</td><td>40-90-2-05</td><td></td></tr><tr><td>Fiji software</td><td>Instituto Nacional de Saúde</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Fina</td> Ferramentas <td>de Ciências Finas</td><td>14558-11</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>16220-14</td><td></td></tr><tr><td>Esponjas de Gelatina</td><td>Coltene</td><td>274-007</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-5137</td><td></td></tr><tr><td>Han' s Estimulador de Nervo Acupoint</td><td>Jason Scientific</td><td>HANS-200A</td><td></td></tr><tr><td>Cânula de Intubação</td><td>Harward Apparatus</td><td>73-2737</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>RWD</td><td>R510</td><td></td></tr><tr><td>LAS X</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Camundongos Pirt-cre Universidade</td><td>Johns Hopkins N</td><td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Camundongos Rosa-GCaMP6s&nbsp; (AI96)</td><td>Jax Laboratory</td><td>28866</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador espinhal</td><td>N/A</td><td>N/A</td> Tesoura de mola <td>feito-à-medida</td></tr> Ferramentas <tr><td></td><td>de ciência fina</td><td>15023-10</td><td></td></tr><tr><td>Tribromoetanol</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>A mola de Vannas Scissors</td><td>ferramentas de ciência fina</td><td>15019-10</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo imagem de cálcio da resposta dos neurônios dos gânglios da raiz dorsal a estímulos somáticos e viscerais

In Vivo Calcium Imaging of Dorsal Root Ganglia Neurons' Response to Somatic and Visceral Stimuli

Uma técnica é descrita para expor cirurgicamente o gânglio da raiz dorsal (DRG) do lombar-6 em um camundongo de laboratório vivo e anestesiado, juntamente com o protocolo para imagens de cálcio in vivo do DRG exposto em resposta a vários estímulos viscerais e somáticos. Camundongos Pirt-GCaMP6s ou camundongos C57BL6 injetados intratecalmente com vírus AAV empacotados com GCaMP6s foram utilizados para capturar transientes de Ca2+. A amplitude desses transientes indica sensibilidade a modalidades sensoriais específicas. As fibras aferentes se originam de órgãos internos, com corpos celulares neuronais primários nos gânglios espinhais ou vagais. Estudos sobre nocicepção visceral e analgesia por acupuntura podem potencialmente ser conduzidos em neurônios sensoriais primários usando tecnologias avançadas de imagem, como imagens de cálcio in vivo, permitindo o registro de conjuntos de atividade neuronal no animal intacto durante a estimulação ou intervenção. As respostas dos conjuntos de neurônios DRG a estímulos somáticos e viscerais aplicados aos seus campos receptivos correspondentes foram registradas. Essa técnica ilustra como as populações neuronais reagem a vários tipos de estímulos somáticos e viscerais. É possível comparar de forma abrangente as respostas do conjunto neuronal a diferentes estímulos, o que é uma abordagem particularmente valiosa na pesquisa sobre dor visceral e mecanismos segmentares de estimulação somática, como a acupuntura.

Após seguir o protocolo acima, o gânglio da raiz dorsal lombar-6 de um camundongo transgênico Pirt-GCaMP6s foi exposto, e estímulos viscerais de distensão retal ou acupuntura somática foram aplicados ao reto ou ao campo receptivo. Este experimento teve como objetivo observar o número e os tipos de neurônios ativados por diferentes estímulos viscerais de distensão retal e estímulos somáticos.
Como mostrado em Figura 2A, a maioria dos neurônios no gânglio da raiz dorsal lombar-6 não exibe fluorescência GFP em condições basais. Essa fluorescência basal pode ser influenciada por dois fatores: o nível de expressão de GCaMP e o possível dano causado ao gânglio da raiz dorsal durante a cirurgia. Estímulos de CRD resultaram em um aumento rápido e transitório da fluorescência de GCaMP, e os números e intensidades de GFP aumentaram, como pode ser observado em Figura 2B. Alterações semelhantes ocorreram em Figura 2C quando a eletroacupuntura (EA) em BL25 (Dachangshu) foi aplicada18. BL25 está localizado a 3 mm ao lado da linha dorsal mediana do segmento inferior 4th coluna lombar, que é comumente utilizada quando há distúrbios intestinais inferiores20. As células selecionadas e numeradas estão circuladas em Figura 2D usando o software de imagem.
Conforme descrito no protocolo acima, consideraram-se respostas positivas as alterações na intensidade de fluorescência acima de um nível limiar de ≥30% de F0. Cores pseudo-coloridas foram adicionadas para mostrar a imagem mesclada de neurônios que responderam tanto ao CRD (vermelho) quanto ao EA (verde) na Figura 2E. Houve um neurônio mesclado que respondeu tanto ao CRD quanto ao EA, conforme indicado pela seta na Figura 2E. O mapa de calor e o gráfico de linhas nas Figura 2F e Figura 2H representam as respostas de todos os neurônios circulados no software de imagem ao CRD. Figura 2G exibe um gráfico de histograma dos diferentes diâmetros dos neurônios responsivos ao CRD. O mapa de calor e o gráfico de linhas nas Figura 2I e Figura 2K representam as respostas de todos os neurônios circulados no software de imagem ao EA no BL25. Figura 2J exibe um gráfico de histograma dos diferentes diâmetros dos neurônios responsivos ao EA. Além de analisar o número e as intensidades fluorescentes dos neurônios responsivos, é possível analisar diferentes respostas de neurônios no gânglio da raiz dorsal (DRG) de diversos tamanhos quando diferentes estímulos são aplicados, conforme mostrado nas Figura 2G,J.
Uma vez identificado um único neurônio, também é possível analisar as respostas das mesmas células ou células adjacentes a diferentes estímulos. Isso permite o exame das interações temporais e espaciais entre diferentes estímulos viscerais e somáticos no nível do gânglio da raiz dorsal (DRG).
<img alt="Cirurgia em camundongo com configuração de imagem, exposição do nervo, microscópio confocal, ventilador em diagrama experimental." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65975/65975fig01v4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Procedimento cirúrgico para o gânglio da raiz dorsal lombar-6. (A) A traqueotomia do animal experimental. (B) Vista superior mostrando três vértebras expostas, sendo o lado esquerdo rostral e o lado direito caudal. (C) O grampo espinal personalizado. Observe o suporte ajustável, que permite o alinhamento preciso do gânglio da raiz dorsal exposto e do objetivo de imagem, mantido em ângulo perpendicular. Os grampos espinais são controlados por unidades esféricas universais, facilitando o ajuste fino do gânglio da raiz dorsal gravado e do objetivo. (D) Aplicação do grampo espinal e exposição do gânglio da raiz dorsal antes da aquisição de imagens. (E) Imagens ampliadas fornecem uma visão mais detalhada do gânglio da raiz dorsal lombar-6 esquerdo exposto. (F) Representação do ventilador de anestesia e da plataforma personalizada utilizada neste procedimento. (G) O processo de aquisição de imagens do gânglio da raiz dorsal sob a lente do objetivo. (H) Uma representação esquemática da estimulação somática e visceral durante a gravação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65975/65975fig01largev4.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Imagem de cálcio e análise de dados da ativação neuronal; mapas de calor, gráficos de fluorescência, CRD, EA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65975/65975fig02v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Imagens representativas e análise da imagem de cálcio in vivo de neurônios do gânglio da raiz dorsal lombar-6. (A-C) Imagens representativas mostram neurônios do gânglio da raiz dorsal lombar-6 durante a linha de base, após CRD e após estímulos de EA em BL25. (D) As imagens ilustram células identificadas e numeradas dentro de um único gânglio da raiz dorsal lombar-6 após o rastreamento celular utilizando o software de imagem. (E) Imagens sobrepostas exibem conjuntos de neurônios do gânglio da raiz dorsal lombar-6 que respondem aos estímulos de CRD (em vermelho) e EA (em verde). Barras de escala = 100 µm. (F), (H), (I), (K) Mapa de calor e gráfico de linhas mostram as variações na intensidade de fluorescência nas células rastreadas em resposta aos estímulos de CRD e EA. (G), (J) Representação do número de células responsivas de diferentes tamanhos aos estímulos de CRD e EA. As barras de erro indicam média ± erro padrão da média. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65975/65975fig02largev3.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>

O presente protocolo descreve imagens de cálcio in vivo para medir as respostas de conjuntos de neurônios lombares-6 DRG a estímulos somáticos e viscerais. Comparações completas podem ser feitas entre neurônios que respondem a diferentes estímulos. Este protocolo é valioso para investigar mecanismos de dor visceral e estimulação somática, como a acupuntura.

in vivo Imagem de cálcio da resposta dos neurônios dos gânglios da raiz dorsal a estímulos somáticos e viscerais

A technique is described for surgically exposing the dorsal root ganglion (DRG) of the lumbar-6 in a live, anesthetized laboratory mouse, along with the ...

in-vivo-calcium-imaging-dorsal-root-ganglia-neurons-response-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Fonte: Shannonhouse, J., et al. In vivo Imagem de cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios da raiz dorsal intactos. J. Vis. Exp. (2023). O vídeo demonstra uma técnica de imagem de cálcio in vivo para monitorar a atividade neuronal nos gânglios da raiz dorsal (DRG) de um camundongo transgênico. Os neurônios DRG expressam um indicador de cálcio que aumenta a intensidade da fluorescência ao se ligar ao cálcio. Estímulos mecânicos ou térmicos aplicados a...

Imagem de cálcio in vivo de conjuntos neuronais nos gânglios intactos da raiz dorsal de um camundongo

Com o seu pequeno corpo transparente, neuroanatomia bem documentado e uma série de técnicas genéticas passíveis e...

Na imagem cálcio vivo Neuronal em C. elegans

Este protocolo descreve a exposição cirúrgica do gânglio da raiz dorsal (DRG) seguida de GCaMP3 (indicador Ca2+ codificado geneticamente; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Imagem de Ca2+ dos conjuntos neuronais usando camundongos Pirt-GCaMP3 enquanto se aplica uma variedade de estímulos na pata traseira ipsilateral.

In vivo Imagem com cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios intactos da raiz dorsal

Indicadores de cálcio codificados geneticamente (GECI) permitem uma análise robusta em nível populacional da sinalização de neurônios sensoriais. Aqui, desenvolvemos uma nova abordagem que permite a visualização in vivo do GECI da atividade dos neurônios dos gânglios trigeminais de ratos.

In-Vivo Imagem de cálcio de neurônios sensoriais no gânglio trigeminal de ratos

Este estudo apresenta uma manipulação cirúrgica para expor o T-DRG em camundongos anestesiados para imagens de cálcio in vivo , juntamente com registros de ECG síncronos. Este método representa uma ferramenta de ponta para estudar a estimulação elétrica nervosa periférica e as entradas de órgãos viscerais torácicos, bem como suas interações no nível sensorial primário.

Imagem de cálcio dos gânglios da raiz dorsal torácica (DRG) in vivo e registro de ECG para estudar a estimulação de nervos periféricos

Este protocolo descreve imagens de cálcio GCaMP in vivo de neurônios intactos do gânglio do trigêmeo (TG). Esta descrição inclui cirurgia de exposição TG, imagem de microscopia confocal in vivo de neurônios TG, aplicação de estímulos somáticos durante imagens microscópicas de neurônios TG e análise de dados de imagem de cálcio GCaMP in vivo .

In vivo Imagem de cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios trigêmeos intactos

Nós apresentamos um método para imunoprecipitação da cromatina do tecido da raiz dorsal após lesão axonal gânglios. A abordagem pode ser usada para identificar locais de transcrição específicos fator determinante e importante modificação epigenética de histonas e DNA para a regeneração de axônios lesados ​​tanto no sistema nervoso periférico e central.

Cromatina imunoprecipitação de Tissue Dorsal Root Gânglios seguintes Lesão Axonal

Imagens ao vivo de axônios da raiz dorsal após rizotomia

GABAérgica inibição pré-sináptica é um poderoso mecanismo de inibição na espinal medula importante para o motor e a integração do sinal sensorial em redes da medula espinal. Subjacente despolarização aferente primário pode ser medido por registo dos potenciais de raiz dorsal (DRP). Aqui demonstramos um método in vivo de gravação de DRP em ratinhos.

Medindo Spinal pré-sináptica Inibição em Ratos por raiz dorsal Gravação Potencial<em&gt; In Vivo</em

Gânglios da raiz dorsal (DRG) são estruturas que contêm os neurónios sensoriais do sistema nervoso periférico. Quando dissociada, podem ser co-cultivadas com células estaminais do tipo SC, derivadas de tecido adiposo (ASC), proporcionando um valioso modelo para estudar a regeneração de nervos em vitro e mielinização, simulando o ambiente in vivo, no local da lesão.

Dorsal Root Ganglia neurônios e células-tronco diferenciadas adiposo-derivados: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-cultura modelo para estudar a regeneração do nervo periférico

Aprenda imagem de cálcio in vivo em neurônios do gânglio da raiz dorsal lombar-6 de camundongos para estudar respostas a estímulos somáticos e viscerais. Este método avança a compreensão dos mecanismos da dor visceral e dos efeitos analgésicos da acupuntura.

in vivo Imagem de cálcio da resposta dos neurônios dos gânglios da raiz dorsal a estímulos somáticos e viscerais

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