Name: membrane proteins in liposome models
Uploaded: 2023-04-30T06:31:34.000Z
Duration: 7 min 5 s
Channel: JoVE

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HS-LS1-3.

Reconstitution of Membrane Proteins

Reconstituição é o processo de devolução de uma biomolécula isolada à sua forma ou função original. Isso é particularmente útil para estudar proteínas de membrana, que permitem funções celulares importantes e afetam o comportamento de lipídios próximos. Para estudar a função das proteínas de membrana purificadas in situ, elas devem ser reconstituídas integrando-as em uma membrana lipídica artificial.
Este vídeo introduz conceitos de reconstituição de proteínas de membrana e procedimentos relacionados, como isolamento de proteínas utilizando detergente, formação de vesículas artificiais utilizando lipídios, incorporação da proteína isolada na vesícula artificial e separação do detergente da solução. Por fim, duas aplicações são cobertas: a reconstituição de proteínas de transporte de membranas e a reconstituição de proteínas de colheita de luz.

reconstituição de proteínas de membrana

Reconstituição é o processo de devolução de uma biomolécula isolada à sua forma ou função original. Isso é particularmente útil para estudar proteínas de membrana, que permitem funções celulares importantes e afetam o comportamento de lipídios próximos. Para estudar a função das proteínas de membrana purificadas in situ, elas devem ser reconstituídas integrando-as em uma membrana lipídica artificial.
Este vídeo introduz conceitos de reconstituição de proteínas de membrana e procedimentos relacionados, como isolamento de proteínas utilizando detergente, formação de vesículas artificiais utilizando lipídios, incorporação da proteína isolada na vesícula artificial e separação do detergente da solução. Por fim, duas aplicações são cobertas: a reconstituição de proteínas de transporte de membranas e a reconstituição de proteínas de colheita de luz.
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Reconstituição é o processo de restauração de uma biomolécula isolada à sua forma ou funcionalidade original. Essa abordagem é frequentemente utilizada no estudo de proteínas de membrana, que permitem muitos processos celulares importantes e afetam o comportamento dos lipídios vizinhos. No entanto, a complexidade do ambiente celular torna as funções da proteína da membrana difíceis de estudar in situ. As proteínas podem ser extraídas e purificadas, mas suas funções reais não podem ser avaliadas sem uma membrana. Portanto, proteínas isoladas de membrana são reconstituídas pela integração em uma membrana lipídica artificial, como um lipossomo. Este vídeo introduzirá os princípios da reconstituição da proteína da membrana, um procedimento geral de reconstituição e algumas aplicações na bioquímica.
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As membranas celulares consistem principalmente em fosfolipídios e proteínas de membrana. Os fosfolipídios formam uma bicamada na qual as cabeças de fosfato hidrofílico interagem com o interior aquoso e exterior da célula, enquanto as caudas de ácido graxo hidrofóbico interagem entre si na bicamada.
Algumas proteínas de membrana só interagem com a membrana por interações eletrostáticas ou não covalentes. Outros, chamados de "proteínas integrais", estão incorporados na bicamadas lipídica.
Assim como a bicamadas, as proteínas integrais têm extremidades hidrofílicas e um centro hidrofóbico, e são mantidas no lugar por interações hidrofóbicas. Proteínas integrais que abrangem toda a membrana são conhecidas como "proteínas transmembranas".
As interações entre essas proteínas e a membrana são tão fortes que mesmo a lise das células não as separará. Um surfactante especial chamado detergente é usado para extrair as proteínas. Semelhante aos fosfolipídios, os detergentes têm cabeças hidrofílicas e caudas lipofílicas, e podem entrar na membrana livremente.
Dentro da membrana, as caudas lipofílicas do detergente interagem com o núcleo de proteína hidrofóbica. Isso envolve a proteína com uma casca das cabeças de detergente hidrofílico, o que interrompe as interações proteína-lipídicas.
O complexo de detergente proteico é agora facilmente separado da membrana. O detergente torna o complexo solúvel em soluções aquosas, e pronto para a reconstituição em uma membrana artificial.
Proteínas são frequentemente reconstituídas nas membranas dos lipossomos, que são vesículas artificiais. Para preparar lipossomos, os lipídios secos são hidratados e agitados para induzir a formação de vesículas. Quando um detergente é adicionado, ele é incorporado nas membranas liposso.
Para reconstituir a proteína, as proteínas solubilizadas e lipossomos são combinados, e então o detergente é removido da solução por diálise ou adsorção química. As proteínas e lipossomos rapidamente se reúnem em proteoliposomes, de modo que apenas os grupos hidrofílicos são expostos. As proteínas então funcionam como em uma membrana celular, e podem ser investigadas isoladamente.
Agora que cobrimos o básico da reconstituição de proteínas, vamos passar por cima de um protocolo para reconstituir proteínas de membrana em lipossomos.
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Para começar a isolar as proteínas da membrana, as células são lísedas. Células ininterruptas são removidas com centrifugação.
O supernante é centrifugado a uma velocidade mais alta para pelotar as membranas. A pelota é re-suspensa e um detergente é adicionado para extrair as proteínas.
Os detritos restantes das células são removidos por centrifugação adicional. A proteína é purificada do supernaspeico com cromatografia de coluna e, em seguida, concentrada ou purificada ainda mais conforme necessário.
Para começar a preparar os lipossomos, uma suspensão de fosfolipídios em solvente orgânico é seca sob nitrogênio ou argônio.
Os fosfolipídios são hidratados com tampão de hidratação, e a mistura é sônica para terminar de criar os lipossomos.
O detergente é adicionado para solubilizar os lipossomos, que é então combinado com as proteínas.
O detergente é então removido por adsorção em contas de poliestireno, diálise ou uma coluna de ligação de detergente. Os proteolipósmos resultantes estão prontos para serem purificados e usados em experimentos subsequentes.
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Agora que você está familiarizado com o básico de um procedimento de reconstituição de proteínas de membrana, vamos olhar para algumas aplicações de reconstituição de proteínas na bioquímica.
Uma proteína de transporte de membrana foi reconstituída para obter uma compreensão mais clara de seu mecanismo de transporte. Sua função pós-reconstituição foi verificada com um efflux de íons iodetos. Em seguida, a atividade de transporte foi estudada na presença de vários inibidores e potencializadores de canais de íons de moléculas pequenas. Dessa forma, as interações diretas dessas pequenas moléculas com a proteína de transporte poderiam ser estudadas.
Proteínas de membrana de ligação de clorofila e carotenoides nas plantas colhem luz, promovem a separação da carga e mitigam danos leves. Ao reconstituir essas proteínas de colheita de luz, sua dinâmica dobrável e interação com pigmentos podem ser estudadas. As proteínas de colheita leve reconstituídas com esta técnica tinham propriedades ópticas muito semelhantes às proteínas nativas. A espectroscopia de emissão de fluorescência pode então ser usada para estudar a transferência de energia de pigmentos para as proteínas reconstituídas de colheita de luz.
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Você acabou de ver o vídeo do JoVE sobre a reconstituição de proteínas de membrana. A reconstituição é uma maneira de transferir proteínas importantes para uma imitação celular para uma investigação mais aprofundada. Este vídeo abordou os princípios da reconstituição de proteínas, um protocolo de reconstituição e algumas aplicações em bioquímica. Obrigado por assistir!
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Reconstituição de Proteínas de Membrana

Reconstitution is the process of returning an isolated biomolecule to its original form or function. This is particularly useful for studying membrane ...

A reconstituição é o processo de restauração de uma biomolécula isolada à sua forma ou funcionalidade original. Essa abordagem é frequentemente usada ao estudar proteínas de membrana, que permitem muitos processos celulares importantes e afetam o comportamento dos lipídios vizinhos. No entanto, a complexidade do ambiente celular dificulta o estudo das funções das proteínas de membrana "in situ". As proteínas podem ser extraídas e purificadas, mas suas funções reais não podem ser avaliadas sem uma membrana. Portanto, as proteínas de membrana isoladas são "reconstituídas" pela integração em uma membrana lipídica artificial, como um lipossomo. Este vídeo apresentará os princípios da reconstituição de proteínas de membrana, um procedimento geral de reconstituição e algumas aplicações em bioquímica. As membranas celulares consistem principalmente em fosfolipídios e proteínas de membrana. Os fosfolipídios formam uma bicamada na qual as cabeças de fosfato hidrofílico interagem com o interior e o exterior aquosos da célula, enquanto as caudas de ácidos graxos hidrofóbicos interagem entre si na bicamada. Algumas proteínas de membrana só interagem com a membrana por interações eletrostáticas ou não covalentes. Outros, chamados de 'proteínas integrais', estão embutidos na bicamada lipídica. Como a bicamada, as proteínas integrais têm extremidades hidrofílicas e um centro hidrofóbico, e são mantidas no lugar por interações hidrofóbicas. As proteínas integrais que abrangem toda a membrana são conhecidas como 'proteínas transmembranares'. As interações entre essas proteínas e a membrana são tão fortes que mesmo a lisagem das células não as separará. Um surfactante especial chamado detergente é usado para extrair as proteínas. Semelhante aos fosfolipídios, os detergentes têm cabeças hidrofílicas e caudas lipofílicas e podem entrar livremente na membrana. Dentro da membrana, as caudas lipofílicas do detergente interagem com o núcleo hidrofóbico da proteína. Isso envolve a proteína com uma casca das cabeças de detergente hidrofílico, o que interrompe as interações proteína-lipídio. O complexo proteína-detergente agora é facilmente separado da membrana. O detergente torna o complexo solúvel em soluções aquosas e pronto para reconstituição em uma membrana artificial. As proteínas são frequentemente reconstituídas nas membranas dos lipossomas, que são vesículas artificiais. Para preparar lipossomas, os lipídios secos são hidratados e agitados para induzir a formação de vesículas. Quando um detergente é adicionado, ele é incorporado às membranas dos lipossomas. Para reconstituir a proteína, as proteínas solubilizadas e os lipossomas são combinados e, em seguida, o detergente é removido da solução por diálise ou adsorção química. As proteínas e lipossomas se montam rapidamente em proteolipossomas, de modo que apenas os grupos hidrofílicos são expostos. As proteínas então funcionam como fariam em uma membrana celular e podem ser investigadas isoladamente. Agora que abordamos os fundamentos da reconstituição de proteínas, vamos examinar um protocolo para reconstituir proteínas de membrana em lipossomas. Para começar a isolar as proteínas da membrana, as células são lisadas. As células intactas são removidas com centrifugação. O sobrenadante é centrifugado a uma velocidade mais elevada para granular as membranas. O pellet é ressuspenso e um detergente é adicionado para extrair as proteínas. Os restos celulares restantes são removidos por centrifugação adicional. A proteína é purificada do sobrenadante com cromatografia em coluna e, em seguida, concentrada ou purificada conforme necessário. Para iniciar a preparação dos lipossomas, uma suspensão de fosfolipídios em solvente orgânico é seca sob nitrogênio ou argônio. Os fosfolipídios são hidratados com tampão de hidratação e a mistura é sonicada para terminar de criar os lipossomas. O detergente é adicionado para solubilizar os lipossomas, que são então combinados com as proteínas. O detergente é então removido por adsorção em esferas de poliestireno, diálise ou uma coluna de ligação de detergente. Os proteolipossomas resultantes estão prontos para serem purificados e usados em experimentos subsequentes. Agora que você está familiarizado com os fundamentos de um procedimento de reconstituição de proteínas de membrana, vejamos algumas aplicações da reconstituição de proteínas em bioquímica. Uma proteína de transporte de membrana foi reconstituída para obter uma compreensão mais clara de seu mecanismo de transporte. Sua função pós-reconstituição foi verificada com um efluxo de íons iodeto. Em seguida, a atividade de transporte foi estudada na presença de vários inibidores e potencializadores de canais iônicos de moléculas pequenas. Dessa forma, as interações diretas dessas pequenas moléculas com a proteína de transporte puderam ser estudadas. As proteínas de membrana de ligação à clorofila e aos carotenóides nas plantas captam luz, promovem a separação de carga e mitigam os danos causados pela luz. Ao reconstituir essas proteínas coletoras de luz, sua dinâmica de dobramento e interação com pigmentos podem ser estudadas. As proteínas coletoras de luz reconstituídas com esta técnica tinham propriedades ópticas muito semelhantes às proteínas nativas. A espectroscopia de emissão de fluorescência pode então ser usada para estudar a transferência de energia dos pigmentos para as proteínas coletoras de luz reconstituídas. Você acabou de assistir ao vídeo de JoVE sobre reconstituição de proteínas de membrana. A reconstituição é uma forma de transferir proteínas importantes para um imitador celular para uma investigação mais aprofundada. Este vídeo abordou os princípios da reconstituição de proteínas, um protocolo de reconstituição e algumas aplicações em bioquímica. Obrigado por assistir!

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Química

Biochemistry

Bioquímica

membrane proteins in liposome models

Membrane proteins can be moved into liposome models so their function can be studied outside a cell. Reconstitution means restoring an isolated biomolecule to a working form. For membrane proteins, that usually means placing a purified protein into an artificial lipid membrane.

Cell membranes are made mainly of phospholipids and membrane proteins. The phospholipids form a bilayer with hydrophilic phosphate heads facing water and hydrophobic fatty acid tails facing inward. Some membrane proteins attach by noncovalent or electrostatic interactions, while integral proteins are embedded in the bilayer. Transmembrane proteins are integral proteins that span the full membrane, and their strong interactions with the membrane are not broken just by lysing cells.

Detergent is used to extract these proteins. Detergents have hydrophilic heads and lipophilic tails, so they can enter the membrane. Their tails interact with the hydrophobic protein core and surround it with detergent heads, which breaks protein-lipid interactions. The protein-detergent complex becomes soluble in water and is ready for reconstitution.

Liposomes are artificial vesicles often used for this step. They are made by hydrating dried lipids and agitating them to form vesicles. When detergent is added, it becomes part of the liposome membrane. The purified protein and liposomes are then mixed, and the detergent is removed by dialysis or chemical adsorption. As the detergent leaves, the protein and lipids assemble into proteoliposomes, with hydrophilic groups exposed to water. The reconstituted proteins can then work in a membrane-like setting and be studied in isolation.

A general liposome protocol starts with cell lysis. Unbroken cells are removed by centrifugation, and the membranes are pelleted at higher speed. The pellet is resuspended, detergent is added to extract the proteins, and more centrifugation removes leftover debris. The protein is then purified by column chromatography and concentrated if needed.

Liposome preparation follows a separate path. Phospholipids in organic solvent are dried under nitrogen or argon, then hydrated with buffer. Sonication finishes the liposome formation. After detergent is added to solubilize the liposomes, the proteins are combined with them. The detergent is removed with polystyrene beads, dialysis, or a detergent-binding column, leaving proteoliposomes that can be purified and used in later experiments.

Reconstituted membrane proteins have several uses in biochemistry. One transport protein was reconstituted to better understand how it moves molecules. Its activity was checked by the efflux of iodide ions. Researchers also tested small-molecule ion channel inhibitors and potentiators to study how they interact with the transport protein directly.

Plant light-harvesting proteins are another example. These chlorophyll- and carotenoid-binding membrane proteins help harvest light, support charge separation, and reduce light damage. After reconstitution, scientists can study folding dynamics and pigment interactions. The reconstituted proteins showed optical properties very similar to native proteins, and fluorescence emission spectroscopy can be used to follow energy transfer from pigments to the proteins.

Membrane Proteins in Liposome Models

dialysis: diffusion based separation

Dialysis for Buffer Exchange in Biochemistry

Dialysis is a common biochemistry technique for buffer exchange and desalting. It separates molecules by diffusion through a semipermeable membrane, which lets small molecules pass while holding larger biomolecules inside the sample. The membrane is the key part of the setup. Its pores create a molecular weight cutoff, so a membrane such as a 10 kDa membrane usually keeps molecules larger than 10 kilodaltons inside. This cutoff is not exact, because membranes have a range of pore sizes.

enzyme assays and kinetics

Measuring Enzyme Reaction Rates

Enzyme reaction rates can be measured with assays that track how substrate or product levels change over time. Enzymes are proteins, or sometimes RNAs, that speed up chemical reactions by lowering the activation energy needed to start them. They act on a specific substrate and help form a product that supports life processes. Enzymatic reactions are often described in three steps. First, the substrate binds to the enzyme active site and forms an enzyme-substrate complex. That complex can fall...

maldi-tof mass spectrometry

How MALDI-TOF Reads Biomolecules

MALDI-TOF mass spectrometry reads biomolecules by using a laser, a matrix, and a time-of-flight analyzer. MALDI, or matrix-assisted laser desorption ionization, helps fragile molecules keep their structure while they are moved into the mass analyzer. The analyzer then separates compounds based on size and charge. In MALDI, the sample is mixed into a matrix, usually an organic compound with aromatic and conjugated double bonds. A laser pulse strikes the spot, and the matrix absorbs most of the...

tandem mass spectrometry

Tandem Mass Spectrometry for Biomolecule Analysis

Tandem mass spectrometry is used to isolate a biomolecule and break it into smaller pieces so its makeup can be studied. Because biomolecules often have large, complex structures, it can be hard to identify their molecular composition and sequence from a single measurement. By linking mass spectrometers in series, the technique first selects one ion and then analyzes the fragments it produces. The process starts with an ion source that converts the sample into ions. A mass analyzer then...

protein crystallization

Protein Crystals for Structure Analysis

Protein crystals help scientists study protein structure and function. A crystal is a solid lattice made from purified protein molecules. These crystals are useful in structural biology because they reveal details that methods like mass spectrometry and SDS-PAGE cannot show on their own. Protein crystallization is paired with recombinant protein expression and x-ray diffraction to support this work. The process starts with a large amount of very pure protein. Researchers often make that...

chromatography-based biomolecule purification methods

chromatography-based-biomolecule-purification-methods

Protein Purification with SEC and IMAC

Protein purification with size-exclusion chromatography and affinity chromatography helps isolate biomolecules from complex mixtures. These methods are common in biochemistry because purified samples are needed before a biomolecule’s properties and activity can be studied. The video focuses on the principles behind size-exclusion chromatography, affinity chromatography, and immobilized metal affinity chromatography, or IMAC. Size-exclusion chromatography, or SEC, separates molecules by size. A...

two-dimensional gel electrophoresis

Protein Mapping with 2D Gel Electrophoresis

Protein mapping with 2D gel electrophoresis separates complex protein mixtures across two steps. The method combines isoelectric focusing, or IEF, with sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, or SDS-PAGE. Together, these methods can resolve thousands of biomolecules from a single sample by their isoelectric point and molecular weight. The first dimension is IEF. Each protein has an isoelectric point, or pI, which is the pH where its net charge is zero. Proteins are loaded...

metabolic labeling

Tracking Cell Chemistry with Metabolic Labels

Metabolic labeling tracks cell chemistry by using chemical analogs that cells take up and build into biomolecules. These labels help scientists follow biochemical changes and modifications inside cells. The labeled products can then be studied with tools such as SDS-PAGE and NMR to learn more about metabolic pathways. Several labeling strategies are shown here. Isotopic labeling uses analogs that match the natural molecule but contain uncommon isotopes, such as carbon-13 and nitrogen-15 in an...

electrophoretic mobility shift assay (emsa)

electrophoretic-mobility-shift-assay-emsa

Detecting Protein-DNA Binding by EMSA

Electrophoretic mobility shift assay, or EMSA, is a biochemical method used to detect binding between proteins and nucleic acids. It is also called a gel shift assay. The test compares how a labeled nucleic acid moves through a gel before and after it binds a protein. EMSA is used to see whether a specific protein binds to a specific nucleic acid. First, the nucleic acid is labeled to make a probe. The transcript describes radioactive phosphorus-32 as a common label. The probe is then mixed...

photometric protein determination

Measuring Protein Concentration with Absorbance

Measuring protein concentration with absorbance is a key step in many biochemical assays. Photometric methods use the fact that samples with more light-absorbing material transmit less light. Because concentration and absorption are directly related, this makes it possible to measure an unknown sample. The core idea comes from the Beer-Lambert Law. This law states that the concentration of a light-absorbing species is proportional to its absorbance. The video also introduces the Bradford assay...

density gradient ultracentrifugation

Sucrose Gradient Separation in an Ultracentrifuge

Sucrose gradient separation in an ultracentrifuge is a lab method for isolating cell parts and biomolecules. It uses differences in density to make particles sink or rise in a liquid. A high-speed ultracentrifuge speeds up this process so components can be separated without destroying them. The basic idea starts with a suspension, which is particles mixed in a liquid solvent. Particles that are denser than the solvent sediment, while less dense particles float. A rotor inside the...

co-immunoprecipitation and pull-down assays

co-immunoprecipitation-and-pull-down-assays

Protein Interaction Capture Methods in Cells

Co-immunoprecipitation and pull-down assays are laboratory methods used to capture stable protein-protein interactions. Protein-protein interactions help control many biological functions, but many of them have not yet been identified. These assays are related to immunoprecipitation, which isolates a target protein from a mixed sample using an antibody. In co-immunoprecipitation, or CoIP, an antibody binds the target protein, and that protein is already attached to another protein that the...

reconstitution of membrane proteins

Membrane proteins can be moved into liposome models so their function can be studied outside a cell. Reconstitution means restoring an isolated biomolecule to a working form. For membrane proteins, that usually means placing a purified protein into an artificial lipid membrane. Cell membranes are made mainly of phospholipids and membrane proteins. The phospholipids form a bilayer with hydrophilic phosphate heads facing water and hydrophobic fatty acid tails facing inward. Some membrane...

f&#246;rster resonance energy transfer (fret)

FRET as a Molecular Ruler in Cells

Föster resonance energy transfer, or FRET, is a way to study close-range biochemical interactions using light-emitting molecules. A donor fluorophore can pass energy to an acceptor fluorophore when their emission and absorption spectra overlap. This transfer happens only when the pair is very close together, usually within 10 nm. Because FRET depends on distance, it is often called a molecular or spectroscopic ruler. The strength of the signal is measured as FRET efficiency, which describes...

surface plasmon resonance (spr)

SPR Biosensors for Tracking Binding Kinetics

Surface plasmon resonance, or SPR, is a way to track biomolecular binding on a label-free biosensor. It is used to measure molecular affinity, kinetics, specificity, and concentration. The method works with a thin metal layer on a prism, where changes in reflected light reveal interactions in real time. SPR sensors use a thin layer of a noble metal on the face of a prism. Light is reflected from the prism-metal interface into a photodetector. At one specific angle, called the surface plasmon...

biochemistry

Esta coleção apresenta métodos de purificação comumente usados, como cromatografia de afinidade, bem como métodos analíticos, como MALDI-TOF. Além disso, os vídeos mostram métodos para avaliar a interação e função de biomoléculas, como coimunoprecipitação e marcação metabólica.

See how membrane proteins are extracted with detergent and reinserted into liposomes so students can study transport and light-harvesting function.

Membrane Proteins in Liposome Models | JoVE K12

matter-and-energy-in-organisms-and-ecosystems

Matter and Energy in Organisms and Ecosystems

HS-LS1-5.

HS-LS1-6.

Overview

Principles of Membrane Protein Reconstitution

Protocol for Reconstitution of Membrane Proteins in Liposomes

Applications

Summary

Characteristics of Life

Biology is a natural science that studies life and living organisms, including their structure, function, development, interactions, evolution, ...

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Cell Structure

Background
Cells represent the most basic biological units of all organisms, whether it be simple, single-celled organisms like bacteria, or large, ...

Visualizing Onion and Cheek Cells
ExpandImmediately before the experiment, wash and peel onion bulbs for the class.
Remove the entire brown outer skin and ...

Visualizing Onion and Human Cells
ExpandIn this experiment you will prepare different types of cells from a plant and animal, onion and human ...

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Cell Diversity

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Nucleic Acids

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Development and Reproduction of the Laboratory Mouse

Successful breeding of the laboratory mouse (Mus musculus) is critical to the establishment and maintenance of a productive animal colony. Additionally, ...

Construct an explanation based on evidence for how the structure of DNA determines the structure of proteins which carry out the essential functions of life through systems of specialized cells.

HS-LS1-1.

Membrane Proteins in Liposome Models

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