Name: detecting protein-dna binding by emsa
Uploaded: 2023-04-30T06:31:38.000Z
Duration: 6 min 57 s
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Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)

O ensaio de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA) é um procedimento bioquímico usado para elucidar a ligação entre proteínas e ácidos nucleicos. Neste ensaio, um ácido nucleico radiolabeled e proteína de teste são misturados. A vinculação é determinada através da eletroforese gel que separa os componentes com base na massa, carga e conformação.
Este vídeo mostra os conceitos da EMSA e um procedimento geral, incluindo preparação de gel e proteína, ligação, eletroforese e detecção. Os aplicativos abordados neste vídeo incluem a análise de enzimas de remodelação de cromatina, uma EMSA modificada que incorpora biontinylation e o estudo de locais de ligação de reguladores de resposta bacteriana.

ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforética (emsa)

O ensaio de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA) é um procedimento bioquímico usado para elucidar a ligação entre proteínas e ácidos nucleicos. Neste ensaio, um ácido nucleico radiolabeled e proteína de teste são misturados. A vinculação é determinada através da eletroforese gel que separa os componentes com base na massa, carga e conformação.
Este vídeo mostra os conceitos da EMSA e um procedimento geral, incluindo preparação de gel e proteína, ligação, eletroforese e detecção. Os aplicativos abordados neste vídeo incluem a análise de enzimas de remodelação de cromatina, uma EMSA modificada que incorpora biontinylation e o estudo de locais de ligação de reguladores de resposta bacteriana.
<div class="chapter_text" id="script_0">
EMSA, o ensaio de mudança de mobilidade eletroforética, também conhecido como ensaio de mudança de gel, é um procedimento bioquímico versátil e sensível. A EMSA elucida a ligação entre proteínas e ácidos nucleicos detectando uma mudança nas bandas em eletroforese de gel.
Este vídeo descreve os princípios da EMSA, fornece um procedimento geral e discute alguns aplicativos.
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<div class="chapter_text" id="script_1">
Replicação, transcrição e reparo de DNA, bem como processamento de RNA são todos processos bioquímicos críticos. Todos envolvem a ligação entre proteínas e ácidos nucleicos. Muitas doenças e transtornos graves estão associados a modificações nessa ligação. A EMSA é uma técnica para determinar qualitativamente se uma proteína específica se liga a um ácido nucleico específico. Primeiro, o ácido nucleico é rotulado, geralmente com fósforo radioativo-32, para criar uma sonda. Em seguida, a proteína de teste e a sonda de ácido nucleico são misturados. Quando uma proteína se liga a uma sonda de ácido nucleico, o complexo resultante tem maior massa e uma conformação diferente do ácido nucleico sozinho.
Uma vez ligados, os complexos são analisados com eletroforese gel. Nesta técnica, um campo elétrico força macromoléculas a migrar através de uma matriz de gel. Os componentes se separam com base na massa, carga e conformação. A eletroforese pode separar complexos de DNA de proteínas de sondas não ligadas. Como possuem diferentes massas e conformações, migrarão através do gel a taxas diferentes e se separarão. A separação é facilmente detectada, graças à presença do fósforo radioativo, e prova que a proteína se liga com sucesso ao ácido nucleico dado. Para verificar a identificação da proteína, um "ensaio supershift" usa um anticorpo com uma afinidade conhecida com a proteína. Isso tem o benefício adicional de mudar ainda mais a resolução complexa e crescente.
Agora que vimos os princípios, vamos ver no laboratório.
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<div class="chapter_text" id="script_2">
Para iniciar o procedimento, a proteína deve ser isolada. Para isso, as técnicas de biologia molecular são usadas para expressar a proteína nas células e, em seguida, purificar.
O ácido nucleico é amplificado e rotulado para criar uma sonda. A rotulagem é feita através de incubação por 10 min com dCTP contendo fósforo radioativo-32. Uma bancada de trabalho segura para radiação e equipamentos de proteção são necessários.
O gel é então preparado. O gel precisa ser não desnaturado, para evitar que a proteína altere a conformação e potencialmente desvincular da sonda durante a eletroforese. Os géis de poliacrilamida têm tamanhos de poros de 5 a 20 nm e são úteis para sondas curtas de até 100 pares de base de comprimento. Os géis agarose têm tamanhos de poros de 70-700 nm e são úteis para sondas maiores.
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<div class="chapter_text" id="script_3">
Com a sonda de proteína e ácido nucleico agora preparada, passamos a nos ligar. Uma solução tampão TRIS é preparada e a proteína e a sonda são adicionadas. O pH deve ser semelhante às condições fisiológicas, e concentração de sal suficiente para evitar que a proteína forme ligações fracas com ácidos nucleicos não-alvo. A reação prossegue por 20-30 min a 4 °C.
O próximo passo é a eletroforese. Um buffer de baixa resistência iônica e um pH semelhante ao usado na reação de ligação é utilizado. Ele produz um "efeito de caging" que estabiliza complexos, aumenta a mobilidade e reduz a geração de calor. Após a eletroforese, os componentes do gel são transferidos para o papel filtro. Em uma sala escura, o papel filtro é então exposto ao filme. Se a proteína se ligar à sonda, duas regiões distintas rotuladas serão visíveis na transferência. Um representando o complexo, e um separado representando a sonda desvinculada. A separação demonstra que a proteína está ligada com sucesso ao ácido nucleico.
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Agora que vimos o procedimento básico, vamos ver algumas aplicações.
Cromatina é o complexo bem embalado de DNA e proteínas encontradas células eucarióticas. Enzimas remodelantes de cromatinas modificam a estrutura para abrir o DNA para transcrição. À medida que isso muda a mobilidade do complexo, a EMSA pode ser usada para explorar a atividade de ligação da enzima.
Uma abordagem alternativa à rotulagem aproveita a interação entre o DNA e a enzima metiltransferase. Um cofator pode ser modificado para se ligar permanentemente ao DNA via metiltransferase. Em vez de rotular com fósforo-32, o cofator é conjugado à biotina, o que é vantajoso porque não é radioativo. Como o cofato é específico do local em seu anexo, é relevante para genotipagem, detecção de metilação e entrega de genes. Os ácidos nucleicos biotinilatados são detectados através da fluorescência ultravioleta.
Quando os estímulos ambientais ativam as quinases histidinas, um "regulador de resposta" é fosfoilado. Isso, por sua vez, se liga ao DNA, afetando a transcrição, que pode ser estudada pela EMSA. Por exemplo, um regulador de resposta em Desulfovibrio vulgaris foi demonstrado para se ligar ao gene de interesse. A EMSA foi usada para verificar se a ligação ocorreu.
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Você acabou de ver o vídeo de JoVE no ensaio de mudança de mobilidade eletroforética. Você deve agora entender seus princípios de operação, os passos em seu procedimento, e seus principais parâmetros operacionais.
Obrigado por assistir!
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Ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforética (EMSA)

The electrophoretic mobility shift assay (EMSA) is a biochemical procedure used to elucidate binding between proteins and nucleic acids. In this assay a ...

EMSA, o ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforética, também conhecido como ensaio de deslocamento de gel, é um procedimento bioquímico versátil e sensível. A EMSA elucida a ligação entre proteínas e ácidos nucléicos detectando uma mudança nas bandas na eletroforese em gel. Este vídeo descreve os princípios da EMSA, fornece um procedimento geral e discute algumas aplicações. A replicação, transcrição e reparo do DNA, bem como o processamento de RNA, são processos bioquímicos críticos. Todos eles envolvem a ligação entre proteínas e ácidos nucléicos. Muitas doenças e distúrbios graves estão associados a modificações nessa ligação. EMSA é uma técnica para determinar qualitativamente se uma proteína específica se liga a um ácido nucléico específico. Primeiro, o ácido nucléico é marcado, geralmente com fósforo-32 radioativo, para criar uma sonda. Em seguida, a proteína de teste e a sonda de ácido nucleico são misturadas. Quando uma proteína se liga a uma sonda de ácido nucléico, o complexo resultante tem maior massa e uma conformação diferente do ácido nucléico sozinho. Uma vez ligados, os complexos são analisados com eletroforese em gel. Nesta técnica, um campo elétrico força as macromoléculas a migrar através de uma matriz de gel. Os componentes se separam com base na massa, carga e conformação. A eletroforese pode separar complexos proteína-DNA de sondas não ligadas. Como eles têm massas e conformações diferentes, eles migrarão através do gel em taxas diferentes e se separarão. A separação é facilmente detectada, graças à presença do fósforo radioativo, e prova que a proteína se liga com sucesso ao ácido nucléico fornecido. Para verificar a identificação da proteína, um "ensaio supershift" usa um anticorpo com uma afinidade conhecida com a proteína. Isso tem o benefício adicional de mudar ainda mais a resolução complexa e crescente. Agora que vimos os princípios, vamos vê-los no laboratório. Para iniciar o procedimento, a proteína deve ser isolada. Para fazer isso, técnicas de biologia molecular são usadas para expressar a proteína nas células e depois purificar. O ácido nucléico é amplificado e marcado para criar uma sonda. A marcação é feita por meio de incubação por 10 min com dCTP contendo fósforo-32 radioativo. São necessários uma bancada de trabalho à prova de radiação e equipamento de proteção. O gel é então preparado. O gel precisa ser não desnaturante, para evitar que a proteína altere a conformação e potencialmente se desligue da sonda durante a eletroforese. Os géis de poliacrilamida têm tamanhos de poros de 5 a 20 nm e são úteis para sondas curtas de até 100 pares de bases de comprimento. Os géis de agarose têm tamanhos de poros de 70-700 nm e são úteis para sondas maiores. Com a sonda de proteína e ácido nucleico agora preparada, procedemos à ligação. Uma solução tampão TRIS é preparada e a proteína e a sonda são adicionadas. O pH deve ser semelhante às condições fisiológicas e a concentração de sal suficiente para evitar que a proteína forme ligações fracas com ácidos nucléicos não-alvo. A reação prossegue por 20-30 min a 4 ?C.O próximo passo é a eletroforese. Um tampão de baixa força iônica e um pH semelhante ao usado na reação de ligação é utilizado. Ele produz um "efeito de enjaulamento" que estabiliza os complexos, aumenta a mobilidade e reduz a geração de calor. Após a eletroforese, os componentes do gel são transferidos para o papel de filtro. Em uma sala escura, o papel de filtro é então exposto ao filme. Se a proteína se ligar à sonda, duas regiões marcadas distintas serão visíveis na transferência. Um representando o complexo e um separado representando a sonda não ligada. A separação demonstra que a proteína se ligou com sucesso ao ácido nucléico. Agora que vimos o procedimento básico, vamos dar uma olhada em alguns aplicativos. A cromatina é o complexo compactado de DNA e proteínas encontradas nas células eucarióticas. As enzimas de remodelação da cromatina modificam a estrutura para abrir o DNA à transcrição. Como isso altera a mobilidade do complexo, a EMSA pode ser usada para explorar a atividade de ligação da enzima. Uma abordagem alternativa para a rotulagem aproveita a interação entre o DNA e a enzima metiltransferase. Um cofator pode ser modificado para se ligar permanentemente ao DNA via metiltransferase. Em vez de marcar com fósforo-32, o cofator é conjugado à biotina, o que é vantajoso porque não é radioativo. Como o cofator é específico do local em sua ligação, ele é relevante para a genotipagem, detecção de metilação e entrega de genes. Os ácidos nucléicos biotinilados são detectados por fluorescência ultravioleta. Quando estímulos ambientais ativam histidina quinases, um "regulador de resposta" é fosforilada. Isso, por sua vez, se liga ao DNA, afetando a transcrição, que pode ser estudada pela EMSA. Por exemplo, um regulador de resposta em? Desulfovibrio vulgaris demonstrou se ligar ao gene de interesse. A EMSA foi usada para verificar se a ligação ocorreu. Você acabou de assistir ao vídeo de JoVE sobre o ensaio de mudança de mobilidade eletroforética. Agora você deve entender seus princípios de operação, as etapas de seu procedimento e seus principais parâmetros operacionais. Obrigado por assistir!

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Química

Biochemistry

Bioquímica

detecting protein-dna binding by emsa

Electrophoretic mobility shift assay, or EMSA, is a biochemical method used to detect binding between proteins and nucleic acids. It is also called a gel shift assay. The test compares how a labeled nucleic acid moves through a gel before and after it binds a protein.

EMSA is used to see whether a specific protein binds to a specific nucleic acid. First, the nucleic acid is labeled to make a probe. The transcript describes radioactive phosphorus-32 as a common label. The probe is then mixed with the test protein, and any binding changes the size and shape of the complex.

The bound and unbound molecules are then separated by gel electrophoresis. An electric field pulls macromolecules through a gel matrix. They separate by mass, charge, and conformation. Protein-DNA complexes move differently from free probe, so the shifted band shows that binding occurred. A supershift assay can also confirm the protein’s identity. In that step, an antibody with known affinity binds the protein and shifts the complex even further.

The lab procedure begins by isolating the protein. Molecular biology methods are used to express the protein in cells and then purify it. The nucleic acid is amplified and labeled to form the probe. Because phosphorus-32 is radioactive, a radiation-safe workbench and protective equipment are required during labeling.

The gel must be non-denaturing so the protein does not change conformation or fall off the probe during electrophoresis. Polyacrylamide gels have pore sizes of about 5 to 20 nm and are used for short probes up to 100 base pairs long. Agarose gels have larger pores, about 70 to 700 nm, and are used for larger probes. After the protein and probe are ready, they are mixed in TRIS buffer for binding.

The binding reaction uses a pH close to physiological conditions. The salt concentration must be high enough to reduce weak, non-target binding. The reaction runs for 20 to 30 min at 4 °C. Electrophoresis is then done in a buffer with low ionic strength and a similar pH. This creates a caging effect that helps stabilize complexes, increases mobility, and reduces heat generation.

After the gel runs, the components are transferred onto filter paper. The paper is exposed to film in a dark room. If binding occurred, two labeled regions appear: one for the protein-nucleic acid complex and one for the unbound probe. That separation shows the protein successfully bound the nucleic acid.

EMSA is useful in several research areas. Chromatin-remodeling enzymes can be studied because they change chromatin structure and affect DNA mobility. A modified EMSA can use biotinylated nucleic acids instead of radioactive labels. This approach is site-specific and useful for genotyping, methylation detection, and gene delivery. It is also detected through ultraviolet fluorescence.

The assay can also help study bacterial response regulators. When environmental stimuli activate histidine kinases, a response regulator becomes phosphorylated and binds DNA to affect transcription. The transcript gives an example from Desulfovibrio vulgaris, where EMSA was used to confirm binding to a gene of interest. EMSA therefore provides a sensitive way to study protein-nucleic acid interactions and their role in DNA replication, transcription, repair, and RNA processing.

Detecting Protein-DNA Binding by EMSA

dialysis: diffusion based separation

Dialysis for Buffer Exchange in Biochemistry

Dialysis is a common biochemistry technique for buffer exchange and desalting. It separates molecules by diffusion through a semipermeable membrane, which lets small molecules pass while holding larger biomolecules inside the sample. The membrane is the key part of the setup. Its pores create a molecular weight cutoff, so a membrane such as a 10 kDa membrane usually keeps molecules larger than 10 kilodaltons inside. This cutoff is not exact, because membranes have a range of pore sizes.

enzyme assays and kinetics

Measuring Enzyme Reaction Rates

Enzyme reaction rates can be measured with assays that track how substrate or product levels change over time. Enzymes are proteins, or sometimes RNAs, that speed up chemical reactions by lowering the activation energy needed to start them. They act on a specific substrate and help form a product that supports life processes. Enzymatic reactions are often described in three steps. First, the substrate binds to the enzyme active site and forms an enzyme-substrate complex. That complex can fall...

maldi-tof mass spectrometry

How MALDI-TOF Reads Biomolecules

MALDI-TOF mass spectrometry reads biomolecules by using a laser, a matrix, and a time-of-flight analyzer. MALDI, or matrix-assisted laser desorption ionization, helps fragile molecules keep their structure while they are moved into the mass analyzer. The analyzer then separates compounds based on size and charge. In MALDI, the sample is mixed into a matrix, usually an organic compound with aromatic and conjugated double bonds. A laser pulse strikes the spot, and the matrix absorbs most of the...

tandem mass spectrometry

Tandem Mass Spectrometry for Biomolecule Analysis

Tandem mass spectrometry is used to isolate a biomolecule and break it into smaller pieces so its makeup can be studied. Because biomolecules often have large, complex structures, it can be hard to identify their molecular composition and sequence from a single measurement. By linking mass spectrometers in series, the technique first selects one ion and then analyzes the fragments it produces. The process starts with an ion source that converts the sample into ions. A mass analyzer then...

protein crystallization

Protein Crystals for Structure Analysis

Protein crystals help scientists study protein structure and function. A crystal is a solid lattice made from purified protein molecules. These crystals are useful in structural biology because they reveal details that methods like mass spectrometry and SDS-PAGE cannot show on their own. Protein crystallization is paired with recombinant protein expression and x-ray diffraction to support this work. The process starts with a large amount of very pure protein. Researchers often make that...

chromatography-based biomolecule purification methods

chromatography-based-biomolecule-purification-methods

Protein Purification with SEC and IMAC

Protein purification with size-exclusion chromatography and affinity chromatography helps isolate biomolecules from complex mixtures. These methods are common in biochemistry because purified samples are needed before a biomolecule’s properties and activity can be studied. The video focuses on the principles behind size-exclusion chromatography, affinity chromatography, and immobilized metal affinity chromatography, or IMAC. Size-exclusion chromatography, or SEC, separates molecules by size. A...

two-dimensional gel electrophoresis

Protein Mapping with 2D Gel Electrophoresis

Protein mapping with 2D gel electrophoresis separates complex protein mixtures across two steps. The method combines isoelectric focusing, or IEF, with sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, or SDS-PAGE. Together, these methods can resolve thousands of biomolecules from a single sample by their isoelectric point and molecular weight. The first dimension is IEF. Each protein has an isoelectric point, or pI, which is the pH where its net charge is zero. Proteins are loaded...

metabolic labeling

Tracking Cell Chemistry with Metabolic Labels

Metabolic labeling tracks cell chemistry by using chemical analogs that cells take up and build into biomolecules. These labels help scientists follow biochemical changes and modifications inside cells. The labeled products can then be studied with tools such as SDS-PAGE and NMR to learn more about metabolic pathways. Several labeling strategies are shown here. Isotopic labeling uses analogs that match the natural molecule but contain uncommon isotopes, such as carbon-13 and nitrogen-15 in an...

electrophoretic mobility shift assay (emsa)

Electrophoretic mobility shift assay, or EMSA, is a biochemical method used to detect binding between proteins and nucleic acids. It is also called a gel shift assay. The test compares how a labeled nucleic acid moves through a gel before and after it binds a protein. EMSA is used to see whether a specific protein binds to a specific nucleic acid. First, the nucleic acid is labeled to make a probe. The transcript describes radioactive phosphorus-32 as a common label. The probe is then mixed...

photometric protein determination

Measuring Protein Concentration with Absorbance

Measuring protein concentration with absorbance is a key step in many biochemical assays. Photometric methods use the fact that samples with more light-absorbing material transmit less light. Because concentration and absorption are directly related, this makes it possible to measure an unknown sample. The core idea comes from the Beer-Lambert Law. This law states that the concentration of a light-absorbing species is proportional to its absorbance. The video also introduces the Bradford assay...

density gradient ultracentrifugation

Sucrose Gradient Separation in an Ultracentrifuge

Sucrose gradient separation in an ultracentrifuge is a lab method for isolating cell parts and biomolecules. It uses differences in density to make particles sink or rise in a liquid. A high-speed ultracentrifuge speeds up this process so components can be separated without destroying them. The basic idea starts with a suspension, which is particles mixed in a liquid solvent. Particles that are denser than the solvent sediment, while less dense particles float. A rotor inside the...

co-immunoprecipitation and pull-down assays

co-immunoprecipitation-and-pull-down-assays

Protein Interaction Capture Methods in Cells

Co-immunoprecipitation and pull-down assays are laboratory methods used to capture stable protein-protein interactions. Protein-protein interactions help control many biological functions, but many of them have not yet been identified. These assays are related to immunoprecipitation, which isolates a target protein from a mixed sample using an antibody. In co-immunoprecipitation, or CoIP, an antibody binds the target protein, and that protein is already attached to another protein that the...

reconstitution of membrane proteins

Membrane Proteins in Liposome Models

Membrane proteins can be moved into liposome models so their function can be studied outside a cell. Reconstitution means restoring an isolated biomolecule to a working form. For membrane proteins, that usually means placing a purified protein into an artificial lipid membrane. Cell membranes are made mainly of phospholipids and membrane proteins. The phospholipids form a bilayer with hydrophilic phosphate heads facing water and hydrophobic fatty acid tails facing inward. Some membrane...

f&#246;rster resonance energy transfer (fret)

FRET as a Molecular Ruler in Cells

Föster resonance energy transfer, or FRET, is a way to study close-range biochemical interactions using light-emitting molecules. A donor fluorophore can pass energy to an acceptor fluorophore when their emission and absorption spectra overlap. This transfer happens only when the pair is very close together, usually within 10 nm. Because FRET depends on distance, it is often called a molecular or spectroscopic ruler. The strength of the signal is measured as FRET efficiency, which describes...

surface plasmon resonance (spr)

SPR Biosensors for Tracking Binding Kinetics

Surface plasmon resonance, or SPR, is a way to track biomolecular binding on a label-free biosensor. It is used to measure molecular affinity, kinetics, specificity, and concentration. The method works with a thin metal layer on a prism, where changes in reflected light reveal interactions in real time. SPR sensors use a thin layer of a noble metal on the face of a prism. Light is reflected from the prism-metal interface into a photodetector. At one specific angle, called the surface plasmon...

biochemistry

Esta coleção apresenta métodos de purificação comumente usados, como cromatografia de afinidade, bem como métodos analíticos, como MALDI-TOF. Além disso, os vídeos mostram métodos para avaliar a interação e função de biomoléculas, como coimunoprecipitação e marcação metabólica.

Learn how EMSA detects protein-DNA binding with labeled probes, gel electrophoresis, and band shifts. See the steps and common applications.

Detecting Protein-DNA Binding by EMSA | JoVE K12

matter-and-energy-in-organisms-and-ecosystems

Matter and Energy in Organisms and Ecosystems

HS-LS1-6.

Inheritance and Variation of Traits

HS-LS3-1.

Earth and Space Sciences

Human Sustainability

HS-ESS3-3.

Overview

Principles of EMSA

Protein and Gel Preparation

Binding, Electrophoresis, and Detection

Applications

Summary

Characteristics of Life

Biology is a natural science that studies life and living organisms, including their structure, function, development, interactions, evolution, ...

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Cell Structure

Background
Cells represent the most basic biological units of all organisms, whether it be simple, single-celled organisms like bacteria, or large, ...

Visualizing Onion and Cheek Cells
ExpandImmediately before the experiment, wash and peel onion bulbs for the class.
Remove the entire brown outer skin and ...

Visualizing Onion and Human Cells
ExpandIn this experiment you will prepare different types of cells from a plant and animal, onion and human ...

What are Cells?

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The concept of a cell started with microscopic observations of dead cork tissue by Robert Hooke in 1665. Hooke coined the term &#34;cell&#34; based on the ...

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Detecting Protein-DNA Binding by EMSA

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