Isolamento de DNA e Análise de Enzimas de Restrição
At the end of this lab, students should know...
Quais são as etapas essenciais do isolamento do DNA?
As etapas essenciais do isolamento do DNA são a colheita celular, a lise, a degradação de proteínas e a precipitação do DNA.
Como é determinada a quantidade e a pureza do DNA?
Os cientistas usam um espectrofotômetro, que mede a intensidade de um feixe de luz passado por uma amostra em função de seu comprimento de onda. Ao quantificar a saída de comprimentos de onda específicos para ácidos nucléicos ou impurezas, pode-se não apenas quantificar a quantidade de DNA, mas também estimar a pureza da amostra de DNA.
O que é uma enzima de restrição?
É uma enzima de origem bacteriana que pode reconhecer sequências específicas de DNA e cortá-las em segmentos nesses locais.
Como a eletroforese em gel é usada para análise de DNA?
Os cientistas podem carregar DNA em um gel em uma câmara de eletroforese e passar corrente elétrica através do gel. O DNA carrega cargas negativas, o que faz com que os fragmentos de DNA migrem em direção ao ânodo. No entanto, os poros do gel retardam fragmentos de DNA maiores em relação a sequências de DNA menores, portanto, as peças se separam de acordo com seu tamanho.
Por que o perfil genético é importante?
O isolamento e o perfil do DNA foram os primeiros passos fundamentais para muitos dos avanços no século passado; desde a identificação da função do gene até as revoluções da agricultura e da ciência forense. Além disso, esses avanços recentemente abriram caminho para a medicina personalizada com melhores resultados de tratamento.
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Palitos de picolé (1/grupo)5
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Funis de vidro (1/grupo)5
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Tubos cônicos de 15 mL (2/grupo)10
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Copos (1/grupo)5
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Solução de NaCl a 1% (10 mL em copo/grupo)50
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Marcador permanente (1/grupo)5
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Copo para coleta de resíduos (1/grupo)5
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Tampão de lise I: tampão TE com SDS (TES Buffer) (1 mL/grupo)5 mL
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Tampão de lise II: tampão TE sem SDS (1 mL/grupo)5 mL
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Proteinase K (10 μL/grupo)50 μL
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2,5 M NaCl (100 μL/grupo)500 μL
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Etanol 100% (4°C) (1 mL/grupo)5 mL
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Hastes de vidro (2/grupo)10
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Cronômetro (1/grupo)10
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Tubos de microfífuga (1,5 mL) (um béquer cheio/estação)1 por estação
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Flutuantes1 por estação
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Celular com câmera1 por grupo
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Conjuntos de pipetas automatizados (1 μL-1 mL)-1 Dependente do tamanho do laboratório
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Ponteiras de pipeta (1 μL-1 mL) 1caixa cada/grupo-1 Dependente do tamanho do laboratório
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Centrífuga de microfuga-1 Dependente do tamanho do laboratório
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Banho-maria (definido para 56°C)-1 Dependente do tamanho do laboratório
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Água livre de nuclease (alíquota de 125 μL/grupo)125 μL
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DNA Lamda (12 μL/grupo)12 μL
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Tampão NEB 2.1 (15 μL/grupo)15 μL
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Enzima de restrição 1 (StuI) (1 μL/grupo)1 μL
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Enzima de restrição 2 (BsrGI) (1 μL/grupo)1 μL
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Cronômetro (1/grupo)5
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Resfriador de enzimas-1 Dependente do tamanho do laboratório
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Banho-maria (definido para 37°C)-1 Dependente do tamanho do laboratório
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Computador com conexão à internet-1 Dependente do tamanho do laboratório
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Pó de agarose-1 Dependente do tamanho do laboratório
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Tampão Tris-Acetato-EDTA-1 Dependente do tamanho do laboratório
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Coloração de gel segura Syber (10.000X) (gel de 10 μl/100mL)-1 Dependente do tamanho do laboratório
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Corante de carregamento 6X-1 Dependente do tamanho do laboratório
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1 kb DNA Ladder-1 Dependente do tamanho do laboratório
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Balança de pesagem1 whole class
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Microondas1 whole class
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Aparelho de gel de DNA1 whole class
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Transiluminador UV1 whole class
- Preparação de Soluções e Materiais
- NOTA: Para que este laboratório funcione sem problemas, é recomendável não exceder 12 amostras por classe de laboratório.
- Primeiro reúna os materiais necessários, incluindo palitos de picolé, funis, tubos cônicos de 15 mL, micropipetas, baldes de gelo com gelo, copinhos e tubos de microcentrífuga.
- Em seguida, defina o banho-maria usado na primeira parte do exercício de laboratório para 56 °C.
- Defina um segundo banho-maria a ser usado na segunda parte do exercício de laboratório a 37 °C.
- Para fazer o tampão TE, primeiro meça 400 mL de água RO.
- Em seguida, adicione cinco mL de 1M Tris-HCL pH 8 e, em seguida, 1 mL de solução de EDTA 0,5 M.
- Em seguida, adicione água RO suficiente para levar a solução até 500 mL.
- Para fazer tampão TE com tampão SDS ou TES, meça novamente 400 mL de água RO.
- Adicione cinco mililitros de 1M Tris-HCL pH 8 e, em seguida, adicione 1 mL de solução de EDTA 0,5 molar.
- Agora adicione 5 mL de solução SDS a 10%.
- Aumente o volume para 500 mL, usando água RO.
- Em seguida, prepare a solução salina a 1% que os alunos usarão para coletar as células da bochecha. Em uma garrafa de refrigerante vazia e limpa, dissolva 5 g de NaCl em 500 mL de água RO.
- Despeje alíquotas de 10 mL em pequenos copos para os alunos usarem, um por grupo de alunos.
- Depois disso, prepare uma quantidade suficiente de alíquotas de 10 mL de etanol 100% para os alunos usarem. NOTA: Armazene essas alíquotas de etanol no freezer ou na geladeira para mantê-las de preferência geladas.
Q1: What materials do you need to prepare before starting a DNA isolation lab?
Gather popsicle sticks, funnels, 15 mL conical tubes, micropipettes, ice buckets with ice, small cups, and microcentrifuge tubes. Prepare two water baths set to 56°C and 37°C for different lab stages. Limit the lab to no more than 12 samples per class to ensure smooth execution and proper handling of all materials.
Q2: How do you prepare TE buffer for DNA isolation?
Measure 400 mL of reverse osmosis (RO) water, then add 5 mL of 1M Tris-HCl pH 8 and 1 mL of 0.5 M EDTA solution. Fill the remaining volume to 500 mL with RO water. This buffer protects DNA during isolation and restriction enzyme analysis procedures.
Q3: What is the difference between TE buffer and TES buffer?
TES buffer includes all TE buffer components—400 mL RO water, 5 mL of 1M Tris-HCl pH 8, and 1 mL of 0.5 M EDTA—plus an additional 5 mL of 10% SDS solution. The SDS detergent helps lyse cell membranes during DNA extraction. Both are brought to 500 mL final volume with RO water.
Q4: How should you prepare the saline solution for cheek cell collection?
Dissolve 5 grams of NaCl in 500 mL of reverse osmosis water in a clean soda bottle to create a 1% saline solution. Distribute 10 mL aliquots into small drinking cups, providing one cup per student group for collecting cheek cells during the lab.
Q5: Why is ethanol stored in the freezer or refrigerator before the lab?
Ethanol is stored ice-cold to facilitate DNA precipitation during the isolation process. Prepare 10 mL aliquots of 100% ethanol and keep them refrigerated or frozen. Cold ethanol increases DNA solubility differences, making it precipitate more effectively from the aqueous solution.
Q6: What temperature settings are required for the water baths in this lab?
Set one water bath to 56°C for part one of the laboratory exercise and a second water bath to 37°C for part two. These specific temperatures optimize enzyme activity and cell lysis during different stages of DNA isolation and restriction enzyme analysis.
Q7: How much TE buffer or TES buffer should you prepare for a typical lab class?
Prepare 500 mL of TE buffer or TES buffer as the standard preparation volume. Since the lab accommodates up to 12 samples per class, this volume provides sufficient buffer for cell lysis, DNA extraction, and subsequent washing steps across all student groups.