Isolamento de DNA e Análise de Enzimas de Restrição
- Isolamento de DNA
- NOTA: Neste experimento, você realizará o isolamento do DNA em duas condições experimentais: uma usando um tampão contendo o detergente SDS e outra sem detergente. Hipóteses: A hipótese alternativa para este experimento pode ser que a amostra preparada sem SDS, um detergente aniônico forte que quebra as membranas celulares, produzirá menos DNA do que a amostra preparada com SDS. A hipótese nula para este experimento pode ser que ambas as amostras produzirão uma quantidade igual de DNA.
- Para começar a coletar uma amostra de tecido para isolamento de DNA. Aqui você estará usando suas próprias células da bochecha. Use um palito de picolé para raspar o interior das bochechas por aproximadamente 30 s. IMPORTANTE: Não raspe com força suficiente para causar dor ou tirar sangue.
- Posicione um funil em um tubo cônico de 15 mL.
- Em seguida, tome 10 mL da solução salina a 1% fornecida a você em um copo rotulado e agite-a na boca sem engolir.
- Continue agitando por 90 s e, em seguida, cuspa a solução salina contendo as células da bochecha no funil para coletar no tubo cônico.
- Em seguida, rotule dois tubos de microcentrífuga vazios com suas iniciais.
- Rotule um dos tubos como +SDS e o outro como -SDS para diferenciar os dois tratamentos.
- Em seguida, adicione 1,5 a 2 mL da solução salina contendo as células da bochecha a cada tubo.
- Gire os tubos em uma microcentrífuga por 30 s.
- Remova os tubos da microcentrífuga e despeje cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar as células coletadas no fundo de cada tubo.
- Encha os tubos com mais solução salina contendo as células da bochecha e repita a centrifugação.
- Repita este processo tomando cuidado para distribuir uniformemente as células entre os tubos +SDS e -SDS até que todas as células da bochecha tenham sido coletadas.
- Em seguida, adicione 1 mL de tampão de lise contendo SDS ao tubo marcado como +SDS e, em seguida, ressuspenda o pellet celular pipetando para cima e para baixo.
- Em seguida, adicione 1 mL de tampão de lise sem SDS ao tubo marcado com -SDS e ressuspenda o pellet celular pipetando para cima e para baixo.
- Depois disso, adicione 10 μL de proteinase K a cada tubo e, em seguida, coloque cuidadosamente os tubos no banho-maria a 56 ºC por 10 min.
- Após 10 minutos, remova cuidadosamente os tubos do banho-maria e adicione 100 μL de NaCl 2.5 M a cada tubo.
- Feche os tubos com firmeza e inverta várias vezes para misturar.
- Em seguida, rotule um tubo cônico de 15 mL como +SDS e outro com -SDS.
- Despeje o conteúdo de cada tubo de microcentrífuga no tubo cônico de 15 mL correspondente.
- Obtenha uma alíquota de 10 mL de etanol 100% do congelador.
- Segure um dos tubos cônicos em ângulo e distribua lentamente 1 mL de etanol 100% no tubo para formar uma camada sobre o líquido já no tubo.
- Repita este processo para o segundo tubo cônico.
- Agora olhe para os dois tubos. Deve haver um precipitado fibroso presente na interface do etanol e na camada aquosa abaixo dele. Este material fibroso contém o DNA isolado. Tire fotos do DNA no tubo e faça anotações descritivas claras e desenhos de suas observações em seu caderno.
- Usando uma vareta de vidro, pegue o DNA do tubo +SDS e examine-o. Repita isso para o tubo -SDS, registrando novamente suas observações. Observe se um dos tubos parece ter mais precipitado do que o outro e por que isso pode acontecer.
- Por fim, descarte todos os resíduos líquidos no recipiente de lixo apropriado e devolva todas as ferramentas aos seus devidos locais no laboratório.
- Resumo Virtual da Enzima de Restrição
- Para estudar como as enzimas de restrição funcionam, primeiro navegue até o site da New England Biolabs: https://www.neb.com/
- Os recursos disponíveis neste site permitem que os pesquisadores executem experimentos virtuais antes de serem realizados no laboratório. Clique em "Ferramentas e recursos" para encontrar a ferramenta NEBcutter e abrir o programa.
- À direita da caixa de pesquisa, encontre a lista que diz "Viral + fago". Nessa lista, selecione Lambda. Este é o nome do DNA que você estará digerindo. Selecione a opção Linear onde a ferramenta diz "a sequência é" e a opção "Enzimas NEB" onde a ferramenta diz "Enzimas a serem usadas". Em seguida, clique em Enviar.
- A próxima página exibirá um mapa de restrição completo do DNA lambda. Este mapa de restrição pode ser usado para prever o que acontecerá se certas enzimas forem usadas. Em seguida, clique em "Resumo personalizado" sob o título "Opções principais".
- Procure a enzima StuI e observe que ela funciona de maneira ideal no tampão 2.1 ou tampão CS. Selecione a enzima StuI e clique em digerir.
- Na próxima janela, clique em "View gel" no cabeçalho "Opções principais". Selecione a opção para executar um gel virtual de 1% usando um resumo pBR322-BstN1.
- Depois que os resultados aparecerem, faça uma captura de tela e cole-a em um documento em branco.
- Depois disso, navegue de volta para a página principal da ferramenta NEBcutter e selecione "Novo resumo personalizado".
- Desta vez, procure a enzima BsrGI e observe que ela tem um desempenho ideal no tampão 2.1 ou no tampão 3.1. Selecione a enzima e clique em digerir.
- No cabeçalho de opções principais, clique em "Exibir gel" e selecione as opções para executar um gel virtual de 1% usando um resumo pBR322-BstN1.
- Faça uma captura de tela dos resultados e salve-a em um documento de texto.
- Por fim, repita essas etapas usando StuI e BsrGI juntos em um único resumo.
- Novamente, faça uma captura de tela e salve o gel resultante.
- Perfil de DNA
- Antes de iniciar os resumos da enzima de restrição, primeiro coloque suas alíquotas de DNA lambda, tampão NEB 2.1, enzima StuI e enzima BsrGI em um balde de gelo e leve-o para sua área de trabalho.
- Rotule um tubo como StuI – isso conterá o resumo StuI.
- Rotule um tubo como BsrGI para conter o resumo do BsrGI.
- Em seguida, rotule um tubo S+B, para conter o resumo com ambas as enzimas.
- Use os micropipetadores apropriados para configurar as reações listadas na Tabela 1:Clique aqui para baixar a Tabela 1
- Primeiro, pipete os 40 μL de água em cada tubo.
- Em seguida, usando uma nova ponta de pipeta de cada vez, dispense 5 μL de tampão 2.1 em cada tubo e pipete para cima e para baixo para misturar.
- Em seguida, adicione 4 μL de DNA lambda a cada tubo e, em seguida, pipete 0,5 μL de cada enzima nos tubos apropriados.
- Finalmente, adicione uma quantidade suficiente de água a cada tubo para elevar o volume total até 50 μL.
- Em seguida, incubar os tubos a 37 ºC durante 15 a 60 min em banho-maria e voltar a colocar os tampões e enzimas no congelador.
- Para preparar um gel de agarose para executar a digestão, em um frasco de 250 mL misture 1 g de pó de agarose com 100 mL de tampão TAE.
- Leve a solução ao micro-ondas durante cerca de 90 s na potência máxima, tendo o cuidado de evitar que a solução transborde.
- Em seguida, remova cuidadosamente a solução do micro-ondas usando uma luva ou almofada térmica e coloque-a para esfriar por cerca de 15 min.
- Enquanto a solução de agarose esfria, configure uma bandeja de fundição.
- Quando a solução de agarose estiver fria, adicione 5 μL de 10.000X SYBR Safe
- Adicione o pente que é usado para fazer os poços do gel à bandeja de fundição do aparelho de eletroforese em gel.
- Despeje a solução de gel de agarose na bandeja de fundição e deixe-a solidificar.
- Quando o gel estiver sólido, puxe o pente para cima para removê-lo do gel e, em seguida, remova as barragens da bandeja de fundição, se apropriado.
- Coloque o gel na câmara de eletroforese com os poços posicionados mais próximos do eletrodo negativo ou preto e encha a câmara com 1x tampão TAE para cobrir completamente o gel.
- Remova suas amostras do banho-maria.
- Em seguida, adicione 8,3 μL de corante de carga 6X a cada amostra.
- Dispense 10 μL do resumo pBR322-BstN1 que contém fragmentos de DNA de tamanho conhecido no primeiro poço.
- Em seguida, carregue 25 μL de amostra StuI no segundo poço.
- Coloque 25 μL de amostra BsRGI no terceiro poço.
- Carregue 25 μL de amostra S+B no quarto poço.
- Para executar o gel, conecte os fios na câmara de eletroforese e depois na fonte de alimentação. O chumbo positivo vermelho deve estar no final mais distante dos poços e o chumbo negativo preto deve estar mais próximo dos poços. Isso ocorre porque as amostras serão executadas de negativas para positivas.
- Ligue a fonte de alimentação e configure a caixa de gel para funcionar a 170 volts por aproximadamente 60 minutos.
- Após a conclusão da execução, desligue a energia da caixa de gel e desconecte os eletrodos do tanque.
- Em seguida, remova o gel da câmara de eletroforese e observe-o com um transiluminador UV. CUIDADO: Proteja os olhos dos raios UV usando óculos de proteção ou usando o escudo fornecido.
- Por fim, use uma câmera de celular para tirar uma foto do gel diretamente de cima e paralelamente à superfície do gel.
- Resultados
- Compare o gel que você executou no laboratório com seu resumo enzimático virtual com StuI.
- O resumo virtual com StuI resultou em sete bandas. Conte as faixas na faixa StuI do seu gel e observe se isso correspondia ao resumo virtual ou parecia mostrar um padrão semelhante. NOTA: Pequenas bandas em géis de eletroforese de agarose são frequentemente invisíveis.
- Agora veja os resultados do seu resumo BsrGI. O resumo virtual com BsrGI resultou em seis bandas. Conte as bandas na faixa BsrGI. Novamente, observe se o resumo virtual e o resumo de laboratório mostraram o mesmo padrão ou um padrão semelhante.
- Por fim, veja o resumo virtual com StuI e BsrGI. O digesto virtual com ambas as enzimas resultou em 12 bandas. Conte as bandas na faixa correspondente do seu gel e considere se o padrão de bandas de DNA é semelhante ao resumo virtual.
Q1: Why is SDS used in the DNA isolation lysis buffer?
SDS is a strong anionic detergent that breaks apart cell membranes, allowing cells to lyse and release their DNA. The experiment compares DNA yield from samples prepared with and without SDS to demonstrate how detergent enhances cell membrane disruption and DNA recovery from cheek cells.
Q2: What is the purpose of proteinase K in DNA isolation?
Proteinase K is an enzyme that digests proteins associated with DNA, including histones and other cellular proteins. Adding proteinase K and incubating samples at 56°C for 10 minutes helps purify the DNA by removing protein contaminants that would otherwise interfere with downstream analysis.
Q3: How does ethanol precipitation isolate DNA from solution?
Ethanol is a nonpolar solvent that causes DNA to become insoluble and precipitate out of the aqueous solution. When 100% ethanol is carefully layered over the cell lysate, stringy DNA precipitate forms at the interface between the ethanol and aqueous layers, allowing visual isolation and collection of the DNA.
Q4: What does a restriction enzyme digest reveal about DNA structure?
Restriction enzymes cut DNA at specific recognition sequences, producing fragments of predictable sizes. By comparing virtual digests to actual gel results, students can verify enzyme specificity and understand how restriction enzyme analysis identifies DNA sequences and creates unique banding patterns for DNA profiling.
Q5: Why are different buffers required for different restriction enzymes?
Restriction enzymes have optimal pH and salt conditions for catalytic activity. StuI works optimally in buffer 2.1 or CS buffer, while BsrGI performs best in buffer 2.1 or buffer 3.1. Using the correct buffer ensures maximum enzyme efficiency and accurate DNA digestion results during restriction enzyme analysis.
Q6: How does gel electrophoresis separate DNA fragments by size?
DNA fragments migrate through an agarose gel matrix when an electric current is applied, with smaller fragments moving faster toward the positive electrode than larger ones. After staining with SYBR Safe dye and UV visualization, distinct bands appear representing DNA fragments of different sizes, allowing comparison between single and double enzyme digests.
Q7: What does combining two restriction enzymes in a single digest demonstrate?
Using both StuI and BsrGI together produces more DNA fragments than either enzyme alone, demonstrating additive cutting at different recognition sites. The virtual digest with both enzymes yields 12 bands compared to 7 for StuI and 6 for BsrGI, illustrating how multiple restriction sites create unique DNA profiles for identification purposes.