Para começar, colete suas placas de cultura alocadas e remova o Parafilm e a tampa de uma delas.
Coloque a placa descoberta sob um microscópio de dissecação e, em seguida, observe as comunidades individuais dentro de cada quadrante da placa.
Em seguida, repita as observações para cada uma das outras duas espécies bacterianas.
Para realizar a coloração de Gram de suas três espécies bacterianas, primeiro rotule as extremidades de três lâminas de microscópio com as iniciais de cada espécie de bactéria, suas iniciais e a data. HIPÓTESES: Neste experimento, a hipótese experimental pode ser que é possível elucidar diferentes espécies e formas bacterianas usando a coloração de Gram, e que as bactérias Gram-positivas se covariam de roxo com violeta cristal, enquanto as bactérias Gram-negativas aparecerão rosa devido à contracoloração de safranina. A hipótese nula pode ser que todos os tipos bacterianos reterão as duas manchas igualmente, e a coloração não ajudará a elucidar suas espécies ou formas.
Para iniciar a primeira coloração, prenda um clipe na lâmina para facilitar o manuseio. Para cada esfregaço bacteriano, lembre-se de usar um circuito de inoculação limpo e esterilizado por chama.
Coloque duas voltas de água destilada estéril no centro da lâmina.
Depois de esterilizar a alça novamente, resfrie a alça tocando várias vezes em uma parte não inoculada do ágar.
Em seguida, remova uma pequena quantidade de cultura de uma colônia isolada e misture-a com a água da lâmina.
Deixe a lâmina secar à temperatura ambiente e fixe a mancha passando-a rapidamente por uma chama.
Depois de seco, pipete várias gotas de violeta cristal na lâmina e deixe descansar por dois a três minutos.
Enxágue cuidadosamente a lâmina com água destilada, direcionando o fluxo direto para o topo da lâmina, permitindo que a água escorra suavemente para baixo. Não aponte o fluxo de água diretamente para o esfregaço.
Em seguida, cubra a lâmina com iodo de Gram, deixe-a descansar novamente por dois minutos e depois enxágue suavemente com água destilada.
Descolora a lâmina com etanol a 95% até que a mancha não desapareça mais.
Imediatamente, enxágue a lâmina com água destilada. Isso limitará a descoloração excessiva.
Em seguida, adicione várias gotas de contracoloração de safranina e deixe por 30 s. Isso manchará todas as células Gram-negativas presentes.
Enxágue suavemente a lâmina com água destilada e seque com papel absorvente.
Depois de corar as outras duas lâminas da mesma maneira (etapas 6 a 17), observe cada uma com um microscópio.
Use uma objetiva de baixa potência primeiro para fazer ajustes grosseiros. Quando você encontrar uma seção ideal, passe para as ampliações mais altas.
Depois de obter mais imagens e ajustar o esfregaço com uma objetiva de média potência, adicione óleo de imersão diretamente ao esfregaço. NOTA: O óleo é necessário para objetivas de alta potência que fornecerão as melhores micrografias.
Agora, use lápis de cor para desenhar as bactérias observadas nos círculos de ampliação apropriados e preencha as características observadas na coluna apropriada, observando a forma da bactéria e se ela é Gram-positiva, identificada por coloração roxa mais escura, ou Gram-negativa, identificada com coloração rosa.
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Finalmente, repita a observação, desenho e caracterização das outras duas lâminas bacterianas coradas.
