What materials do you need to set up a bacterial transformation lab?

Each workstation requires an ice bucket, tube rack, two sterile 1.5 mL tubes, two 1 mL aliquots of SOC media, competent E. coli cells, a plasmid tube, LB agar plates, and LB agar ampicillin plates. You'll also need appropriate pipettes, a water bath set to 42°C, and a temperature-controlled shaker at 37°C for the bacterial transformation using plasmids procedure.

Why do competent E. coli cells need to be kept on ice during bacterial transformation?

Competent cells must remain on ice to maintain their ability to take up plasmid DNA. Cold temperatures preserve cell membrane permeability and prevent premature DNA uptake. Once thawed, the cells are placed in the ice bucket until they're ready for the heat shock step at 42°C.

What is the purpose of SOC media in bacterial transformation?

SOC media provides nutrients that allow transformed bacteria to recover and express antibiotic resistance genes after the heat shock. The two 1 mL aliquots are used to culture the cells at 37°C in the temperature-controlled shaker, enabling them to survive selection on ampicillin plates.

How do LB agar and LB agar ampicillin plates differ in bacterial transformation?

LB agar plates support growth of all bacteria, serving as a control to verify cell viability and transformation efficiency. LB agar ampicillin plates contain antibiotic that kills non-transformed cells, allowing only bacteria that successfully incorporated the plasmid to survive and form colonies on selective media.

What temperature conditions are critical for successful bacterial transformation?

Two temperatures are essential: 42°C for the heat shock step, which facilitates plasmid DNA entry into competent cells, and 37°C for the temperature-controlled shaker during recovery in SOC media. These precise temperatures ensure optimal transformation efficiency, cell survival, and gene expression.

Why is the plasmid tube stored in an ice bucket before transformation?

The plasmid tube is kept in the ice bucket to prevent DNA degradation and maintain its integrity before introduction into competent cells. Cold temperatures preserve plasmid stability and ensure the DNA remains viable for successful uptake during the transformation process.

Transformação bacteriana

Conceitos Preparação do instrutor Protocolo do estudante

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No início do século 20, um bacteriologista britânico chamado Frederick Griffith estava trabalhando com a bactéria causadora de pneumonia Streptococcus pneumoniae. Ele realizou um experimento simples usando duas cepas diferentes. Uma cepa é conhecida como cepa S por causa de uma cápsula protetora que faz com que as colônias ou aglomerados que ela forma pareçam lisas e também a torna virulenta ou prejudicial. A segunda foi a cepa R, uma versão da bactéria sem a cápsula protetora, dando às colônias uma aparência áspera e tornando-a não virulenta.

Primeiro, Griffith pegou algumas das bactérias da cepa S e as aqueceu, produzindo uma versão morta pelo calor da cepa S. Em seguida, ele reuniu alguns ratos e os dividiu em quatro grupos. Ele injetou no primeiro grupo a cepa S virulenta e o segundo com a cepa R não virulenta. Ele dosou o terceiro grupo com a cepa S morta pelo calor e, finalmente, combinou a cepa S morta pelo calor e a cepa R juntas, e injetou essa mistura no quarto grupo. Como esperado, os camundongos do primeiro grupo morreram e os do segundo e terceiro grupo sobreviveram. Mas, para surpresa de Griffith, os ratos do último grupo também morreram.

Quando ele publicou seu estudo em 1928, ele chamou esse misterioso processo de transformação, pois especulou a presença de um princípio transformador subjacente, que permitiu que a cepa anteriormente não virulenta se tornasse mortal. Mais tarde, em 1943, Avert, MacLeod e McCarty relataram que esse princípio transformador era provavelmente o ácido desoxirribonucléico, ou DNA, que agora sabemos ser o material de hereditariedade. Essencialmente, o que aconteceu no experimento de Griffith foi que, quando as bactérias foram combinadas, algum DNA vazou da cepa S morta pelo calor e para as células da cepa R, transformando essas bactérias não virulentas e passando as informações para fazer a cápsula protetora, transformando a cepa R em virulenta, agora capaz de matar os animais do quarto grupo.

Avançando para hoje, os cientistas desenvolveram uma maneira muito mais simples de estudar a transformação bacteriana, usando a bactéria E. coli e pequenos loops circulares de DNA chamados plasmídeos. Normalmente, o plasmídeo usado em experimentos de transformação inclui um gene para uma função especial, como resistência a antibióticos. E. coli são um excelente assunto para transformação porque podem exibir uma propriedade chamada competência, a capacidade de absorver DNA do ambiente. Essencialmente, isso significa que, sob certas condições ambientais, como um produto químico ou um choque elétrico ou térmico, a parede celular da E. coli pode se tornar temporariamente permeável e permitir a absorção de DNA do ambiente. Uma vez que o plasmídeo está dentro da E. coli, ele pode ficar no citoplasma de sua nova célula hospedeira e ser replicado e expresso ao longo de gerações ao lado do genoma, ou pode se incorporar totalmente ao genoma do hospedeiro. Se a bactéria perder o plasmídeo a qualquer momento, a célula também perderá sua resistência aos antibióticos e, portanto, os cientistas cultivam as bactérias em um meio contendo o antibiótico para garantir que os únicos sobreviventes sejam aqueles que contêm o plasmídeo de interesse.

Neste laboratório, você aprenderá como transformar células de E. coli com um plasmídeo contendo um gene de resistência a antibióticos, enquanto pratica técnicas microbiológicas estéreis.