15.13: DNA Complementar

Visão Geral

Apenas genes que são transcritos em RNA mensageiro (mRNA) estão ativos ou expressos. Os cientistas podem, portanto, extrair o mRNA das células para estudar a expressão genética em diferentes células e tecidos. O cientista converte o mRNA em DNA complementar (cDNA) através de transcrição reversa. Como o mRNA não contém intrões (regiões não codificantes) e outras sequências regulatórias, o cDNA—ao contrário do DNA genómico—também permite que os investigadores determinem diretamente a sequência de aminoácidos do peptídeo codificado pelo gene.

Síntese de cDNA

O cDNA pode ser gerado por vários métodos, mas uma maneira comum é primeiro extrair o RNA total das células e, em seguida, isolar o mRNA dos tipos mais predominantes—RNA de transferência (tRNA) e ribossómico (rRNA). O mRNA eucariótico maduro tem uma cauda poli(A)—uma sequência de nucleótidos de adenina—adicionada ao seu terminal 3’, enquanto que outros tipos de RNA não. Portanto, uma cadeia de nucleótidos de timina (oligo-dTs) pode ser anexada a um substrato, como uma coluna ou contas magnéticas, para emparelhar as bases especificamente com as caudas poli(A) do mRNA. Enquanto que o mRNA com cauda poli(A) é capturado, os outros tipos de RNA são lavados.

Em seguida, a transcriptase reversa—uma enzima de DNA polimerase de retrovírus—é usada para gerar cDNA a partir do mRNA. Uma vez que, como a maioria das DNA polimerases, a transcriptase reversa pode apenas adicionar nucleótidos ao terminal 3’ de uma cadeia, um primer poli(T) é adicionado para se ligar à cauda poli(A) para fornecer um ponto de partida para a síntese de cDNA. A cadeia de cDNA termina em um hairpin loop. O RNA é então degradado—comumente com tratamento alcalino ou enzimas RNase—deixando o cDNA de cadeia simples intacto.

Uma segunda cadeia de DNA complementar ao cDNA é então sintetizada pela DNA polimerase—muitas vezes usando o hairpin loop da primeira cadeia do cDNA ou uma porção cortada do mRNA como primer.

O cDNA de cadeia dupla resultante pode ser inserido em vectores bacterianos ou virais e clonado usando técnicas padrão de biologia molecular. Uma biblioteca de cDNA—representando todos os mRNAs nas células ou tecidos de interesse—também pode ser criada para investigações adicionais.

Quase todas as células do corpo tem o mesmo DNA, mas diferentes tipos de células, como neurônios e células musculares, expressam genes diferentes porque apenas alguns genes são transcritos em RNA mensageiro ou mRNA em cada célula. No laboratório, mRNAs podem ser usados como um modelo para sintetizar o DNA complementar, cDNA, para estudar a expressão do gene. Um método comum é extrair RNA das células, em seguida, isolar o mRNA de outros tipos de RNA, como RNA ribossómico ou RNA de transferência, executando a amostra sobre uma coluna de contas com trechos de nucleotídeos de timina anexados.

Estes se ligam à cauda poli uma cadeia de nucleotídeos de adenina especificamente presente nas três pontas principais do mRNA eucariótico. Os outros tipos de RNA não se ligam e são lavados. Após o mRNA ser isolado, um primer poli está ligado para a cauda poli fornecendo um ponto de partida para as enzimas de transcriptase reversa para transcrever uma fita simples cDNA do mRNA.

Químicos, como enzimas RNase são então adicionados para degradar o RNA. Enzimas de DNA polimerase são então utilizadas para sintetizar um fio complementar ao cDNA resultando em cDNA de fita dupla, que pode ser inserido em um vetor bacteriano ou viral e usado em pesquisas de biologia molecular.