What is the purpose of the sand layer in column chromatography?

The sand layer, placed 0.5 cm above the cotton plug, prevents silica gel from passing through the plug into your collected fractions. This protective barrier ensures that only the separated dyes are collected in pure fractions, maintaining the integrity of your samples throughout the separation process.

Why does column chromatography use two different eluents for separating food dyes?

Using ethanol first elutes erioglaucine, which has lower affinity for silica gel, while water elutes tartrazine more effectively due to its higher polarity. This two-solvent approach saves time and minimizes solvent waste while maintaining fraction purity, compared to using a single eluent throughout the entire separation.

How do you prepare the silica gel slurry for column chromatography?

Weigh 5 grams of silica gel powder and mix it with 18 mL of 95% ethanol in a beaker. Stir with a glass rod until the texture is consistent and resembles batter with no dry patches or clumps. The slurry should flow easily to avoid clogging the funnel or trapping air bubbles in the column.

What flow rate should you maintain when eluting dyes through the column?

Adjust the stopcock so the solvent level decreases approximately 1 mL every 15 to 20 seconds. Maintain at least 1 cm of solvent above the silica gel at all times by periodically refilling the column. This controlled solvent flow rate ensures proper separation and prevents band broadening during the elution process.

How do you apply the green food dye to the silica gel column?

Use a clean pipette to gently apply 5 to 7 drops of the dye solution evenly across the top of the silica gel. If necessary, add a few drops of ethanol to keep the silica gel covered. Allow the dye to soak in before beginning the elution process with your chosen eluent.

What do the different colors of fractions tell you about dye affinity for silica gel?

The blue erioglaucine elutes with ethanol, indicating lower affinity for silica gel, while yellow tartrazine requires water, indicating higher affinity. This separation demonstrates that tartrazine binds more strongly to silica gel than erioglaucine does, which is why different solvents are needed to elute each dye effectively.

Why is it important to avoid stopping the column chromatography for extended periods?

Stopping for more than 1 minute at a time causes compound bands to start broadening, which reduces separation quality and makes it harder to collect pure fractions. Continuous flow maintains sharp band definition and ensures efficient separation of the dyes throughout the elution process.

Cromatografia em coluna

Concepts Instructor Prep Student Protocol

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A cromatografia em coluna é uma técnica que usa uma coluna compactada para separar compostos com base em suas interações com uma fase estacionária, que geralmente está na forma de esferas microscópicas. Os espaços entre os grânulos são preenchidos com solvente. A abertura da coluna permite que o solvente flua através da fase estacionária. Quando uma mistura é aplicada no topo da coluna compactada seguida por mais solvente, a mistura se move para a fase móvel e flui através da fase estacionária.

Cada componente da mistura interage com a fase estacionária de uma maneira diferente. Alguns componentes têm interações fracas com a fase estacionária e, portanto, movem-se rapidamente pela coluna, enquanto outros têm fortes interações com a fase estacionária e, portanto, movem-se mais lentamente. Isso separa os diferentes compostos em bandas, que são coletadas em pequenas frações. Isso permite a purificação de cada composto.

Então, que tipo de propriedades podem ser usadas para separar misturas? Uma das propriedades mais comumente usadas é a polaridade. Para isso, o gel de sílica, que é uma forma de dióxido de silício, é frequentemente usado como fase estacionária. O gel de sílica interage com compostos por interações dipolo-dipolo e ligações de hidrogênio através dos grupos -OH que se formam em sua superfície. Assim, os compostos polares interagirão fortemente com a fase estacionária, enquanto os compostos apolares interagirão fracamente.

Outras propriedades que podem ser exploradas para separação incluem tamanho, carga e hidrofobicidade. Uma maneira comum de carregar a fase estacionária na coluna é como uma pasta da fase estacionária e do solvente. Em seguida, a fase estacionária é embalada fluindo mais solvente através da coluna para compactar a pasta. É essencial que a fase estacionária seja embalada uniformemente, sem bolhas de ar, canais vazios ou manchas secas. Isso pode interromper o fluxo e causar a mistura de bandas.

Ao escolher uma coluna, o diâmetro é baseado no volume da amostra a ser separada. A amostra deve cobrir o topo da coluna em uma camada fina e uniforme. Uma camada de amostra mais espessa leva a bandas mais largas. O comprimento da coluna depende de quão bem os compostos se separam na fase estacionária. Compostos com afinidades semelhantes para a fase estacionária requerem uma coluna longa para separação adequada. No entanto, uma mistura de compostos com afinidades muito diferentes para a fase estacionária pode ser separada em uma coluna mais curta.

Neste laboratório, você explorará a cromatografia em coluna primeiro empacotando e preparando uma coluna de sílica gel. Em seguida, você usará sua coluna para separar os componentes coloridos em corante alimentar verde.

Print Procedure Steps

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Fonte: Lara Al Hariri e Ahmed Basabrain na Universidade de Massachusetts Amherst, MA, EUA

Cromatografia de coluna de corante alimentar
Neste experimento, você usará a cromatografia em coluna para separar o corante alimentar verde em seus corantes azuis e amarelos componentes, chamados erioglaucina e tartrazina. Primeiro, você usará etanol a 95% para eluir o corante com uma afinidade mais fraca pelo gel de sílica. Em seguida, você lavará o segundo corante da coluna com água. Para recuperar os corantes purificados, você coletará cada faixa de corante à medida que ela sai da coluna. Esses volumes coletados são chamados de frações.
- Para começar, coloque um jaleco, óculos de segurança e um par de luvas de nitrilo.
- Traga uma coluna ou bureta para a área de abastecimento central. Pegue um pedaço de algodão ou lã de vidro e pressione-o no topo da coluna. Use um fio ou haste longo e sem corte para empurrá-lo para baixo para conectar a coluna logo acima da torneira. nota: O algodão deve ser estável, mas não o embale muito densamente, porque o solvente precisa passar por ele facilmente. Certifique-se de que a torneira pode girar livremente sem travar no plugue.
- Fixe uma braçadeira de bureta a um suporte de laboratório e prenda a coluna na vertical com cerca de 4 polegadas de espaço embaixo dela. Certifique-se de que a torneira está fechada.
- Rotule um copo de 100 mL como 'resíduo' e coloque-o sob a coluna.
- Em seguida, meça 1 g de areia em um barco de pesagem e traga-o de volta para a bancada.
- Em seguida, marque a coluna cerca de 0,5 cm acima do topo do tampão de algodão.
- Coloque um pequeno funil no topo da coluna e despeje areia suficiente através do funil para que haja uma camada de 0,5 cm de profundidade sobre o plugue. Isso evitará que o gel de sílica passe pelo plugue para suas frações.
- Remova o funil e bata suavemente na coluna para distribuir uniformemente a areia.
- Agora, prepare seus eluentes. Rotular um copo de 50 ml e um cilindro graduado de 50 ml como «água».
- Meça 50 mL de água deionizada com o cilindro graduado e despeje no béquer.
- Em seguida, rotular outro copo de 50 mL e um cilindro graduado de 50 mL como 'etanol'. Meça 50 mL de etanol a 95% e despeje neste copo.
- Agora, obtenha 4 ou 5 pipetas Pasteur limpas e um bulbo de pipeta. Pipete suavemente 7 a 8 mL de etanol ao longo das paredes internas da coluna. Esta camada de solvente permitirá que você despeje esta pasta de sílica gel na coluna sem perturbar a areia.
- Abra a torneira e drene ~1 mL de etanol no copo de resíduos para lavar o ar da torneira e confirmar que o solvente flui facilmente através do bujão. Certifique-se de que não haja manchas secas na areia e no plugue e bata suavemente na lateral da coluna para remover as bolhas de ar presas.
- Em seguida, coloque um funil limpo no topo da coluna e rotule um terceiro copo de 50 mL como 'pasta de sílica gel em etanol'.
- Pese cuidadosamente 5 g de pó de sílica gel e despeje-o no copo rotulado.
- Em seguida, traga o gel de sílica, uma haste de vidro e seu cilindro graduado de etanol para a coifa de distribuição de etanol.
- Meça 18 mL de etanol a 95% e despeje no béquer. Mexa a mistura com a vareta de vidro até que a textura fique consistente e não restem manchas secas ou aglomerados de pó. Isso geralmente leva ~ 1 min. Nota: A pasta deve ser espessa, como massa, mas ainda deve fluir facilmente. Se a pasta for muito rígida, ela pode entupir o funil ou prender bolhas de ar na coluna.
- Quando o pó estiver completamente suspenso em etanol, leve-o para a sua bancada. Mexa a pasta até que sua textura fique consistente novamente e despeje-a imediatamente na coluna.
- Bata suavemente nas laterais da coluna enquanto o gel de sílica assenta para se livrar das bolhas de ar.
- Lave o copo com 1 ou 2 ml de etanol e deite o enxaguamento na coluna. Em seguida, remova o funil e reserve.
- Pipete etanol ao longo do interior da coluna para lavar as partículas presas às paredes. Em seguida, drene o solvente até que o menisco esteja um pouco acima do topo do gel de sílica.
- Agora, use um cilindro graduado de 5 ou 10 mL para obter cerca de 0,8 mL da solução de corante alimentar verde.
- Use uma pipeta limpa para aplicar suavemente 5 a 7 gotas da solução de corante uniformemente na parte superior do gel de sílica. Se necessário, adicione algumas gotas de etanol para manter a sílica gel coberta.
- Enquanto espera que o corante seja absorvido, rotule dois copos limpos de 50 mL como 'fração de etanol' e 'fração de água'. Trocar o copo de resíduos sob a coluna pelo copo da fracção de etanol.
- Em seguida, encha a coluna com etanol, pipetando o primeiro mL ao longo das paredes internas para evitar perturbar o gel de sílica.
- Em seguida, abra a torneira parcialmente e ajuste-a até que o nível de solvente diminua ~ 1 mL a cada 15 – 20 s.
- Reabasteça periodicamente a coluna para manter o etanol fluindo. Certifique-se de que haja pelo menos 1 cm de solvente acima da sílica gel o tempo todo.
- Monitore as faixas amarela e azul à medida que se separam. nota: Se você precisar se afastar, feche a torneira para que a coluna não seque enquanto você estiver fora. Evite parar por mais de 1 minuto de cada vez, pois as bandas compostas começarão a se alargar. Geralmente, leva cerca de 20 a 35 minutos para que o corante de movimento mais rápido saia da coluna.
- Depois de coletar todo o corante de movimento mais rápido no béquer da fração de etanol, feche a torneira, coloque a fração de etanol de lado e coloque o copo de resíduos sob a coluna.
- Drene o solvente até que o menisco esteja logo acima do topo da sílica gel. Em seguida, troque o copo de resíduos pelo copo de fração de água.
- Use uma pipeta limpa para encher o topo da coluna com água deionizada. Em seguida, abra a torneira apenas o suficiente para permitir que a água flua pela coluna a uma taxa de cerca de 1 mL a cada 15 a 20 s.
- Reabasteça a coluna com água conforme necessário até que a segunda faixa de cor tenha saído completamente da coluna. Isso geralmente leva mais 15 a 25 minutos. Em seguida, feche a torneira e troque o copo da fração de água pelo copo de resíduos.
- Agora, drene completamente a coluna e deixe a torneira aberta.
- Registre as cores das frações de etanol e água em seu caderno de laboratório.
  Tabela 1: Cromatografia em Coluna de Corante Alimentar
  
  Cor Volume (mL)
  Fração de etanol
  Fração de água
  Clique aqui para baixar a Tabela 1
- Despeje as frações nos cilindros graduados de 50 mL correspondentes e registre o volume de cada fração. Em seguida, feche a torneira e leve a coluna a uma hotte.
- Clamp a coluna na vertical no capô para que o gel de sílica possa secar. Seu instrutor lhe dirá como limpar a coluna ou cuidará dela após o laboratório.
- Agora, despeje as frações coletadas e as sobras de etanol, água e solução de corante pelo ralo e limpe o restante da vidraria como de costume.
- Descarte as pipetas Pasteur usadas nos resíduos de vidro. Jogue fora toalhas de papel usadas e barco de pesagem no lixo do laboratório e limpe a bancada antes de sair.
Results
Neste experimento, você viu que o etanol eluiu a erioglaucina azul em tempo hábil, mas não foi um eluente eficaz para a tartrazina amarela. A cromatografia em papel do corante verde mostra resultados semelhantes. Assim, concluímos que a erioglaucina tem uma afinidade menor pela sílica gel do que a tartrazina.

Agora, considere as vantagens de usar dois solventes para eluir o corante separadamente. A água é mais polar do que o etanol, então presumimos que ela eluiria os dois corantes mais rápido do que o etanol sozinho. Embora você também tivesse usado menos solvente em geral se tivesse usado apenas água, a separação teria sido pior, dificultando a coleta de frações puras.

Alternativamente, você poderia ter continuado usando etanol depois de coletar a erioglaucina, mas levaria muito tempo e muito etanol para eluír a tartrazina dessa maneira. Mudar o eluente para água após a eluição da eriogalacina economizou tempo e minimizou o desperdício de solvente sem sacrificar a pureza.