Espectroscopia UV-Vis de Corantes

Fonte: Lara Al Hariri e Ahmed Basabrain na Universidade de Massachusetts Amherst, MA, EUA

1. Comparação de comprimento de onda de absorbânciaExpandir

   Na primeira parte do laboratório, você usará espectroscopia de absorção de luz ultravioleta e visível, ou espectroscopia de absorção UV-Vis, para analisar as características de absorção de fluoresceína, β-caroteno e corante índigo. Para realizar a espectroscopia UV-Vis, você colocará uma solução entre uma fonte de luz e um fotodetector. As moléculas absorverão luz em comprimentos de onda que correspondem às energias necessárias para excitar seus elétrons e espalhar ou transmitir o resto.

   Um espectro de absorção representa a variação no número de fótons de cada comprimento de onda que atingem o detector. Uma absorbância mais alta corresponde a menos fótons detectados desse comprimento de onda. Você pegará um espectro do solvente puro primeiro, que o instrumento subtrairá do espectro da solução de corante para mostrar apenas os dados de absorbância do corante. Essa referência é chamada de branco de solvente.

   • Antes de começar, coloque um jaleco, óculos de segurança e luvas. nota: As soluções de β-caroteno e índigo usam hexano e dimetilformamida, respectivamente, então você trabalhará com os corantes em uma capela de exaustão. DMF e hexano degradam luvas finas de nitrilo, então troque suas luvas se obtiver solvente nelas.
   • Agora, obtenha uma cubeta de quartzo limpa. As cubetas normalmente têm dois lados transparentes e dois lados texturizados ou opacos. Sempre segure a cubeta pelos lados texturizados para manter os lados transparentes limpos.
   • Primeiro, você analisará uma solução de fluoresceína em água. Para deixar o solvente em branco, encha a cubeta cerca de 3/4 com água deionizada.
   • Agora, limpe os lados transparentes da cubeta com um lenço de laboratório. Verifique se há bolhas de ar na cubeta e bata suavemente na cubeta para desalojá-las.
   • Em seguida, leve a cubeta ao espectrômetro. Abra a câmara de amostra do espectrômetro e limpe sua cubeta uma última vez. Manchas e poeira podem absorver ou refletir a luz, o que introduzirá erros nos dados.
   • Agora, insira a cubeta no porta-amostras de modo que os lados transparentes fiquem alinhados com a fonte de luz. Feche completamente a porta da câmara de amostras. Siga as instruções do software do seu espectrômetro para configurar uma varredura de absorbância de 200 a 800 nm e escaneie sua cubeta como o solvente em branco.
   • Quando a varredura terminar, esvazie a cubeta e use ar comprimido para remover grandes gotas de água.
   • Em seguida, leve-o para o exaustor compartilhado e use uma pipeta Pasteur limpa para encher a cubeta 3/4 com a solução de fluoresceína de 3 μM fornecida.
   • Verifique se há bolhas de ar na cubeta e remova-as conforme necessário antes de levar a cubeta ao espectrômetro. Lembre-se de limpar os lados transparentes uma última vez antes de colocar a cubeta na câmara de amostra. Em seguida, escaneie a cubeta como sua amostra.
   • Quando a varredura terminar, identifique os comprimentos de onda que a fluoresceína absorveu. O comprimento de onda com a maior absorbância é chamado λ_max.
   • Registre os comprimentos de onda dos picos de absorbância e a faixa de absorção geral em seu caderno de laboratório e salve os dados.

     Tabela 1: Absorbância e λ_max dos corantes

     	Faixa de absorbância (nm)	λmax (nm)
     Fluoresceína
     β-caroteno
     anil

     Clique aqui para baixar a Tabela 1
   • Agora, esvazie sua cubeta no lixo aquoso e enxágue-a com água para remover vestígios de fluoresceína.
   • Você analisará o β-caroteno em seguida, então você precisa de um solvente hexano em branco. Enxágue a cubeta com hexano algumas vezes para remover o restante da água antes de enchê-la 3/4 cheia de hexano puro.
   • Remova as bolhas de ar, limpe as laterais da cubeta e coloque-a no espectrômetro. Certifique-se de que a varredura esteja configurada para absorbância de 200 a 800 nm e, em seguida, digitalize a cubeta como um solvente em branco.
   • Quando a varredura terminar, esvazie a cubeta no lixo orgânico e seque-a com ar comprimido.
   • Use uma pipeta limpa para encher a cubeta 3/4 com a solução de β-caroteno 3 μM fornecida e retornar ao espectrômetro.
   • Limpe os lados transparentes da cubeta, coloque-a no espectrômetro e digitalize-a como sua amostra. Escreva os comprimentos de onda dos picos em seu caderno de laboratório e salve os dados.
   • Agora, analise o corante índigo. A solução de índigo está em DMF, então esvazie sua cubeta no lixo orgânico e enxágue o β-caroteno e hexano restantes com DMF puro.
   • Encha a cubeta 3/4 com DMF puro, coloque-a no espectrômetro e certifique-se de que as configurações de varredura sejam as mesmas de antes. Execute a varredura em branco do solvente e, em seguida, esvazie a cubeta no lixo orgânico e seque-a com ar comprimido.
   • Use uma pipeta limpa para encher a cubeta 3/4 com a solução de corante índigo 3 μM fornecida e digitalize-a como sua amostra. Anote as informações de absorbância e salve seus dados.
   • Por fim, esvazie sua cubeta no lixo orgânico e enxágue-a com acetona.
2. β-carotenoExpandir

   Na segunda metade do laboratório, você usará a espectroscopia UV-Vis para relacionar a intensidade e a concentração de absorbância de β-caroteno, medindo as absorbâncias de 5 soluções de β-caroteno com diferentes concentrações. Isso permitirá que você faça uma curva de calibração de absorbância versus concentração de β-caroteno e derive a equação que descreve essa relação.

   • Para começar, faça uma tabela em seu caderno de laboratório com colunas para concentração de β-caroteno e absorbância a 450 nm.

     Tabela 2: Absorbância do β-caroteno

     teste	Concentração (μM)	Absorbância em λmax (450 nm)
     1	1.9
     2	3.7
     3	7.5
     4	11
     5	15

     Clique aqui para baixar a Tabela 2
   • Em seguida, pegue uma cubeta limpa e encha-a 3/4 cheia de hexano como seu solvente em branco.
   • Remova todas as bolhas de ar, limpe os lados transparentes da cubeta e coloque-a no espectrômetro. Configure uma varredura de absorbância de 200 a 800 nm e escaneie a cubeta como o solvente em branco.
   • Quando a varredura terminar, esvazie a cubeta no lixo orgânico e seque-a com ar comprimido.
   • Em seguida, use uma pipeta limpa para encher a cubeta 3/4 com a solução de β-caroteno de 1,9 μM, que é a solução de concentração mais baixa.
   • Limpe as laterais da cubeta, insira-a no espectrômetro e digitalize-a como uma amostra.
   • Quando a varredura terminar, exibir a intensidade de absorbância do pico em 450 nm. Registre isso em seu caderno de laboratório como a absorbância para a solução de 1,9 μM.
   • Agora, esvazie a cubeta no lixo orgânico, enxágue com hexano e seque-a com ar comprimido.
   • Use uma pipeta limpa para encher a cubeta 3/4 cheia da solução de β-caroteno 3,7 μM. Limpe as laterais da cubeta, insira-a no espectrômetro e digitalize-a como outra amostra.
   • Quando a varredura terminar, anote a absorbância do pico a 450 nm. Repita isso para as soluções restantes, trabalhando da concentração mais baixa para a mais alta. Salve seus dados quando terminar.
   • Por fim, esvazie a cubeta no lixo orgânico e limpe-a com acetona.
3. ResultadosExpandir

   Primeiro, observe os espectros dos três corantes. A fluoresceína na água absorve a luz azul e roxa, com a absorbância máxima em 490 nm. Não absorve luz vermelha e absorve apenas um pouco de luz amarela e verde. Consistente com isso, a fluoresceína sólida é vermelha e as soluções de fluoresceína são geralmente amarelas a verdes.

   β-caroteno também absorve luz azul e roxa. A absorbância máxima do β-caroteno no hexano é de 450 nm, e você verá outro grande pico em 478 nm. A forte absorção da luz roxa é parte do motivo pelo qual o β-caroteno parece laranja.

   O índigo no DMF absorve a luz UV e a luz vermelha, laranja e amarela, com um pico distinto em 611 nm. Assim, o corante índigo reflete principalmente a luz azul e roxa, dando-lhe sua cor característica.

   • Agora, faça a curva de calibração para a concentração de β-caroteno. Representar graficamente os valores de absorvância do β-caroteno a 450 nm a partir da segunda metade do laboratório em relação às concentrações das soluções.
   • Em seguida, aplique uma linha de tendência e encontre a equação linear que se ajusta aos dados. De acordo com a lei de Beer-Lambert, nesta equação, y é absorbância, x é concentração e a inclinação é o produto do coeficiente de atenuação molar relevante e do comprimento do caminho.
   • Verifique sua equação. Reorganize-o para resolver a concentração e preencha a absorbância de β-caroteno a 450 nm da primeira parte do laboratório. A concentração calculada deve ser próxima de 3 μM/L.