7.9: Reiniciando garfos de replicação paralisados

A replicação do DNA é iniciada em locais contendo sequências de DNA predefinidas, conhecidas como origens de replicação. O DNA é desenrolado nesses locais pela helicase de manutenção do minicromossomo (MCM) e outros fatores, como Cdc45 e o complexo GINS associado. As fitas simples desenroladas são protegidas pela proteína de replicação A (RPA) até que a DNA polimerase comece a sintetizar o DNA na extremidade 5' do fio na mesma direção do garfo de replicação. Para evitar que a forquilha de replicação se desintegre, um complexo de proteção de forquilha (FPC) acompanha a forquilha em crescimento. Este complexo proteico conservado pode ser encontrado em eucariotos e é composto por proteínas como Tim, Tipin, And1 e Claspin.

No laboratório, os garfos de replicação podem ser paralisados pela ação da hidroxiureia. A hidroxiureia esgota os pools celulares de dNTPs, que são necessários à DNA polimerase para a síntese de DNA. Quando os dNTPs não estão disponíveis, a síntese de DNA fica mais lenta e, por fim, para completamente. Assim, a paralisação dos garfos de replicação nas células vivas está ligada à inatividade da DNA polimerase.

A FPC liga a atividade da polimerase com a da helicase. Assim, mesmo quando a polimerase para, a helicase continua a desenrolar o DNA para produzir um excesso de DNA de cadeia simples (ssDNA) antes de parar. Este excesso de ssDNA assemelha-se a saliências ressecadas do reparo de quebra de fita dupla. Para estabilizar a estrutura, as proteínas RPA ligam-se ao ssDNA e recrutam as proteínas ATR. A ligação do ATR ativa a proteína reguladora do ciclo celular Chk1 para bloquear o disparo das origens de replicação e interromper o ciclo celular para reparo do DNA. Assim, o ssDNA serve como um sinal potente que conecta o dano ao DNA ao reparo.

Enquanto interrompe uma bifurcação de replicação, a DNA polimerase para de sintetizar o DNA nascente. Mas a helicase continua a desenrolar o DNA de fita-dupla para uma forma curta antes de dissociar. Em seguida, a proteína de replicação A, ou RPA, se liga e protege este excesso de DNA uni entrançado no garfo paralisado.

O DNA codificado RPA de fita-única então recruta o complexo Rad9-Rad1-Hus1, ou 9-1-1, que por sua vez permite a ligação de ATR. A ligação ATR desencadeia a fosforilação de Chk1. E Chk1, por sua vez, fosforila a fosfatasse Cdc25.

A fosforilação significa que Cdc25 não pode aceitar mais fosfatos da proteína reguladora do ciclo da célula, Cdk1. Assim Cdk1 permanece inativa, e o ciclo da célula é pausado. Em seguida, antes do reparo começar, uma proteína recombinante, chamado Rad51, substitui o RPA no DNA de fita-simples.

Então, para iniciar a reversão de garfo, Rad51 carrega uma enzima chamada SMARCAL1, no DNA, que age como uma helicase anilha para deslocar e colar os dois novas fitas sintetizadas juntas e forma um cruzamento de quatro vias que se assemelha a um pé de galinha. Este processo é chamado de regressão dos garfos. Há duas maneiras resolver uma regressão de garfos.

Na primeira, BRCA2 estabiliza o filamento nuclear de Rad51 entre os dedos do pé de galinha e protege o garfo remodelado da degradação por nucleasses. Agora, a vertente mais atrasada do nascente pode servir como um molde para estender a vertente principal, assim contornando as lesões na vertente parental. Finalmente, SMARCAL1 inverte o garfo de regressão realinhando os fios parentais.

Aqui, a lesão permanece na vertente pai, mas o modelo de comutação permite que o DNA replicado esteja intacto. A segunda forma de resolver a regressão dos garfos ocorre na ausência de BRCA2. E aqui, a junção quatro-vias do pé de galinha é clivada pela estrutura-específica endonuclease, Mus81, complexada com uma junção endonuclease, Mms4.

A clivagem gera quebras duplas, que podem ser reparadas por recombinação homóloga.