7.16: Recombinação Específica de Sítios Conservados e Variação de Fase

Como os segmentos de DNA são cortados e reorganizados em uma direção específica, a recombinação específica do local surgiu como uma técnica de engenharia genética eficiente. As recombinases Flipase e de Ciclidização ou Flp e Cre, respectivamente, são dois membros da família da tirosina recombinase derivadas de bacteriófagos, que são usadas para mediar inserções de DNA específicas do local, deleções, e expressão direcionada de proteínas em linhas celulares de mamíferos.

Os locais de reconhecimento para a Cre recombinase chamados locais LoxP têm cerca de 34 pares de bases de comprimento. Os locais LoxP contêm sequências palindrómicas de 13 pb, o que significa que a sequência de nucleótidos é lida da mesma forma nas direções de 5’ a 3’ e de 3’ a 5’. A recombinação específica do local mediada por Cre recombinases é um dos métodos mais utilizados na criação de murganhos transgénicos com mutações adquiridas. A utilização de variantes termoestáveis de Cre recombinase com promotores específicos de tecidos permite o controlo espacial da expressão e ação da Cre recombinase. Por exemplo, a colocação de um promotor de Caderina específico para o rim a montante do gene Cre permite que a enzima seja expressa apenas em tecidos renais. Para o controlo temporal da atividade da Cre recombinase, o gene da enzima é fundido com um domínio de ligação a ligandos, de forma a que a enzima seja expressa apenas na presença específica do ligando.

Uma grande limitação ao usar a recombinação específica do local como uma ferramenta de edição do genoma é que o local ou locais de destino de recombinação devem ser inseridos primeiro ou devem estar presentes por acaso. Se um local genómico congruente com o local de reconhecimento da enzima puder ser pré-selecionado, as recombinases podem ser usadas com especificidade alvo “feita por encomenda”. Estudos recentes têm utilizado mutagénese e mistura de genes para desenvolver variantes de Flp que possam reconhecer funcionalmente locais com mutações combinatoriais. Os resultados são promissores para iterações futuras de misturas de genes que podem produzir variantes mais específicas de Flp e podem ser usadas comercialmente como uma ferramenta molecular para a engenharia genética de grandes genomas.