15.2: Isolamento de DNA

Os protocolos de isolamento de DNA podem ser rápidos e diretos ou complexos e demorados, dependendo do tipo e da qualidade do DNA necessário para processamento posterior. Por exemplo, a extração de DNA de plasmídeo é um pouco mais complicada do que a extração de DNA genômico devido à necessidade de um método de lise apropriado para separar o DNA do plasmídeo do gDNA durante o isolamento. No entanto, para aplicações específicas, como sequenciamento de DNA de longo alcance que exigem um bom rendimento de amostras de DNA de alta qualidade, precisamos seguir protocolos específicos até mesmo para extração de DNA genômico.

Tipos de métodos de extração de DNA genômico

O principal objetivo dos métodos de extração de DNA genômico é separar o gDNA de proteínas, RNA e outros conteúdos celulares. Envolve quatro etapas básicas – 1. Ruptura da estrutura celular mecanicamente ou usando produtos químicos para obter o lisado celular 2. Proteção do DNA contra degradação durante o processamento 3. Separação do DNA solúvel dos restos celulares 4. Eluição de DNA purificado.

A maioria dos protocolos de isolamento de DNA genômico são métodos de extração baseados em solução ou em fase sólida. Os métodos baseados em solução dependem de etapas de precipitação e centrifugação para separar o DNA de outro material celular, seguido de extração orgânica ou “salga” para separar o DNA solúvel das proteínas celulares. A precipitação final do DNA é feita usando etanol. Em contraste, os métodos de extração em fase sólida usam suporte sólido, como matrizes de sílica ou celulose, para ligar o DNA, seguido de lavagem e eluição de DNA do suporte sólido. Envolve centrifugação, vácuo ou métodos magnéticos para separar o DNA ligado de outros componentes celulares.

A escolha do método de extração de gDNA depende do tipo de amostra, do número de amostras a serem processadas de uma só vez e da aplicação a jusante do DNA.