Borrão do Sul

Southern blotting é uma técnica em que uma sonda de DNA marcada hibridiza com um DNA alvo para detectar uma sequência específica dentro de um genoma.

A técnica recebeu o nome de Edwin Southern, o biólogo britânico que a desenvolveu pela primeira vez.

O procedimento segue cinco etapas principais: eletroforese, desnaturação, transferência de membrana, hibridização e visualização.

Primeiro, o DNA genômico é digerido por enzimas de restrição e os fragmentos de DNA resultantes são carregados em um gel de agarose e separados por eletroforese em gel.

Para desnaturação ou separação do DNA de fita dupla em dois DNA de fita simples, ou ssDNA, o gel é embebido em uma solução de hidróxido de sódio.

O gel é então colocado em uma esponja em uma solução neutralizante de DNA contendo cloreto de sódio e tampão tris, para redefinir seu pH para 7,0.

Em seguida, uma membrana de náilon é colocada em cima do gel e pesada com uma pilha de toalhas de papel. O ssDNA é transferido para a membrana por ação capilar, enquanto a alta concentração de sal na solução neutralizante ajuda o DNA a se ligar.

Quando irradiado com raios UV, o DNA torna-se covalentemente reticulado à membrana. Isso impede a difusão e imobiliza as bandas de DNA.

A membrana é então embebida em uma solução de DNA de esperma de salmão desnaturado. A solução reveste a membrana e evita qualquer ligação não específica com o DNA da sonda.

As sondas são DNA curto de fita simples que possui uma sequência complementar aos fragmentos de DNA alvo. Para visualização, as sondas são marcadas com um fósforo radioativo - P-32 ou uma enzima que gera um produto facilmente detectável.

Quando a membrana é embebida em uma solução tampão contendo as sondas e aquecida a 42 ° C, o ssDNA alvo emparelha-se com o DNA da sonda complementar para formar um DNA de fita dupla híbrido marcado.

Após a hibridização durante a noite, a membrana é lavada para remover as sondas não ligadas.

Para DNA marcado radioativamente, a membrana é exposta a um filme de raios-X para detecção.

As sondas marcadas com enzimas podem ser detectadas adicionando um substrato apropriado e visualizando as bandas à medida que a cor ou a luminescência se desenvolvem. Como as sondas marcadas se ligam apenas à sequência de DNA de interesse, qualquer banda visível indica a presença do DNA alvo.