RT-PCR em tempo real

A reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa em tempo real, ou RT-PCR em tempo real, pode quantificar um RNA de interesse à medida que a reação progride.

Para começar, a transcriptase reversa copia o RNA em complementar, ou cDNA. A RNase H digere o RNA original, deixando para trás pequenos primers ligados ao cDNA.

Uma fita complementar é então sintetizada pela DNA polimerase.

A amplificação direcionada pode então ser realizada usando PCR para criar cópias exponenciais de segmentos específicos. As duas fitas são separadas no início de cada ciclo em altas temperaturas. Os primers oligonucleotídeos complementares então recozer para cada fita de cDNA e são estendidos pela DNA polimerase.

O DNA pode ser quantificado usando um dos dois métodos diferentes de detecção baseados em fluorescência. Um método usa corantes que só fluorescem quando ligados ao DNA de fita dupla.

O corante se liga ao DNA, onde a fita original é emparelhada com uma fita complementar recém-sintetizada. No final de cada ciclo de PCR, um comprimento de onda apropriado de luz excita o corante ligado.

O outro método usa sondas de oligonucleotídeos específicas de sequência complementares ligadas a um fluoróforo e uma molécula de têmpera.

A reação é continuamente exposta a um comprimento de onda apropriado de luz, e a molécula de atenuador absorve a fluorescência do fluoróforo quando próximas umas das outras. A DNA polimerase separa o fluoróforo durante a extensão, impedindo a extinção.

O método baseado em sonda é específico, pois se conecta apenas à sequência de destino. Em contraste, o método baseado em corante é inespecífico e se liga a todo o DNA de fita dupla.

Em ambos os casos, a fluorescência emitida pelo fluoróforo excitado é detectada por fotodetectores que convertem os sinais recebidos em uma saída digital.

O ciclo de limiar, ou Ct, é o número de ciclos de PCR para que a fluorescência atinja um nível definido bem acima da fluorescência de fundo.

O ciclo de limiar é inversamente proporcional à quantidade de RNA alvo na amostra inicial - quanto menor o ciclo de limiar, maior a quantidade de RNA de interesse.

A quantificação absoluta compara o ciclo de limiar ou intensidade de fluorescência com o de uma curva padrão preparada usando concentrações de DNA conhecidas.

Alternativamente, a quantificação relativa compara a fluorescência de uma amostra com a de uma referência. Este método pode ser usado para comparar mudanças na expressão gênica sob diferentes condições.