RT-PCR em tempo real

A reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa em tempo real, ou RT-PCR em tempo real, pode quantificar um RNA de interesse à medida que a reação progride.

Para começar, a transcriptase reversa copia o RNA em complementar, ou cDNA. A RNase H digere o RNA original, deixando para trás pequenos primers ligados ao cDNA.

Uma fita complementar é então sintetizada pela DNA polimerase.

A amplificação direcionada pode então ser realizada usando PCR para criar cópias exponenciais de segmentos específicos. As duas fitas são separadas no início de cada ciclo em altas temperaturas. Os primers oligonucleotídeos complementares então recozer para cada fita de cDNA e são estendidos pela DNA polimerase.

O DNA pode ser quantificado usando um dos dois métodos diferentes de detecção baseados em fluorescência. Um método usa corantes que só fluorescem quando ligados ao DNA de fita dupla.

O corante se liga ao DNA, onde a fita original é emparelhada com uma fita complementar recém-sintetizada. No final de cada ciclo de PCR, um comprimento de onda apropriado de luz excita o corante ligado.

O outro método usa sondas de oligonucleotídeos específicas de sequência complementares ligadas a um fluorófor