Question 1

Por que o RACE é usado para obter sequências completas de cDNA?

Accepted Answer

RACE é usado porque os novos transcritos de mRNA frequentemente produzem cDNAs parciais com sequências desconhecidas nas extremidades 5' ou 3'. Esta técnica estende sequências de cDNA parciais de um local interno conhecido para as extremidades desconhecidas usando PCR ancorado, permitindo que os pesquisadores obtenham cDNA completo para o transcrito.

Question 2

Como funciona o primer híbrido no 3' RACE?

Accepted Answer

O primer híbrido consiste em uma sequência oligo-dT ligada a uma sequência âncora única. O oligo-dT liga a cauda poli-A na extremidade 3' dos mRNAs maduros, enquanto a âncora adiciona nucleotídeos únicos a montante da sequência poli-T na primeira fita de cDNA recém-sintetizada.

Question 3

Qual é o papel dos primers aninhados na amplificação RACE?

Accepted Answer

Os primers aninhados se ligam a jusante dos primers da primeira rodada de PCR, aumentando a especificidade e o rendimento dos cDNAs completos. Como os primers adaptadores podem amplificar sequências fora do alvo, um segundo ciclo de amplificação com primers aninhados reduz os produtos não específicos e melhora a recuperação do cDNA desejado.

Question 4

Como é que o 5' RACE difere do 3' RACE na obtenção de sequências desconhecidas?

Accepted Answer

Em 5' RACE, um primer específico para o gene se liga ao final 3' do mRNA durante a transcrição reversa, então a desoxirribonucleotidil transferase terminal adiciona uma cauda poli-A ao final 3' do cDNA. Um primer adaptador com oligo-dT e sequências de âncora então sintetiza o filamento complementar para amplificar a sequência 5' ausente.

Question 5

Quais são os primers degenerados e por que podem causar problemas no RACE?

Accepted Answer

Os primers degenerados são projetados como possíveis sequências finais de cDNA previstas a partir das sequências de aminoácidos das proteínas codificadas. Como os aminoácidos são codificados por múltiplos códons de mRNA, prever sequências de nucleotídeos a partir de sequências de proteínas é impreciso, levando os primers degenerados a produzir produtos de PCR indesejáveis.

Question 6

Como os primers GI tail melhoram a especificidade do RACE em comparação com os primers ricos em G?

Accepted Answer

Os primers de cauda GI contêm uma mistura de guaninas e inosina, aumentando a especificidade da PCR e reduzindo a amplificação fora do alvo. Ao contrário dos primers ricos em G que requerem temperaturas de anelamento substancialmente mais altas, os primers de cauda GI anelam-se em temperaturas padrão de PCR, tornando-os mais práticos para aplicações de RACE de rotina.

Question 7

Quais modificações melhoram o desempenho da técnica RACE para obtenção de cDNA completo?

Accepted Answer

As modificações RACE incluem a otimização de sequências de ancoragem, adaptação de sequências de primers para cDNAs específicos, uso de primers degenerados, controle da composição GC, ajuste do comprimento final do cDNA, e emprego de caudas poly(C) com primers híbridos de cauda GI. Essas melhorias aumentam a especificidade e o rendimento de sequências de cDNA completas através de abordagens sequenciamento de próxima geração terminador reversível.

RACE - Amplificação Rápida de Extremidades de cDNA

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