RNA-seq

O sequenciamento de RNA, ou RNA-seq, é uma técnica de sequenciamento de alto rendimento que identifica e quantifica sequências de RNA em uma amostra.

Ele pode ser usado para analisar RNA total ou populações específicas de RNA, como mRNA, tRNA, rRNA e miRNA. A técnica tem diversas aplicações na análise do transcriptoma, análise de expressão gênica diferencial e edição de RNA.

No caso da análise de populações específicas, o tipo de RNA de interesse precisa ser isolado dos outros RNAs. Os mRNAs podem ser isolados usando sondas oligo dT que são complementares às caudas poli A presentes nos transcritos de mRNA. Os microRNAs, que geralmente têm cerca de quinze a trinta nucleotídeos de comprimento, são isolados por métodos de extração baseados em tamanho.

Alternativamente, o RNA contaminante, como o RNA ribossômico, pode ser removido usando oligonucleotídeos complementares ao contaminante e covalentemente ligados a esferas magnéticas. O RNA ribossômico hibridizado é separado da amostra usando um ímã, deixando para trás o RNA de interesse.

O RNA purificado é usado como modelo pela enzima transcriptase reversa para criar cDNA, que é posteriormente amplificado usando PCR para criar uma biblioteca para sequenciamento.

O sequenciamento pode ser realizado por meio de uma das várias tecnologias disponíveis. Em um dos mais comuns, os fragmentos de cDNA são ligados a sequências curtas de oligonucleotídeos conhecidas como adaptadores, que servem como locais de ligação de primer para amplificação por PCR. Os adaptadores também podem ter sequências exclusivas, chamadas sequências de código de barras, que são usadas para marcar e identificar cada fita de cDNA.

A biblioteca é então amplificada usando PCR. Em seguida, é diluído a uma baixa concentração e desnaturado em fitas simples com calor, antes da imobilização em um chip de sequenciamento composto por oligonucleotídeos complementares aos adaptadores.

Uma vez anexado, o DNA de fita simples é clonado usando processos, como amplificação de ponte, para formar aglomerados de DNA com a mesma sequência. Isso garante que os fios de uma área no chip sejam de uma única fonte e emitam um sinal uniforme durante o sequenciamento.

O sequenciamento pode ser específico ou não específico do fio. No caso de protocolos específicos de fita, a fita complementar é lavada e a outra é usada para sequenciamento.

Nucleotídeos marcados com fluorescência são então adicionados às fitas do chip para criar uma nova fita complementar. Uma fluorescência característica é emitida em cada adição, que pode ser lida por um detector.

Vários milhões de aglomerados de fragmentos distintos de cDNA podem ser sequenciados simultaneamente usando esses métodos. Os dados resultantes podem então ser alinhados a um genoma de referência e montados para produzir um mapa de sequência de RNA para análise.