Anotação e montagem do genoma

Todo o genoma de um organismo não pode ser sequenciado em sequências contínuas - mesmo a mais nova geração de tecnologias de sequenciamento produz dados fragmentados de milhares de fragmentos curtos de DNA que variam de 50 a 1000 pb de comprimento.

Essas sequências curtas de DNA - chamadas de leituras - precisam ser montadas para reconstruir a sequência completa de um genoma em um processo chamado montagem do genoma.

Existem quatro etapas principais em qualquer montagem de genoma de próxima geração - análise de dados brutos, montagem de contig, andaime e, finalmente, fechamento de lacunas.

O primeiro passo é analisar os dados brutos adquiridos para qualidade - e então eliminar qualquer contaminação, dados tendenciosos ou leituras de baixa qualidade com um grande número de nucleotídeos desconhecidos.

Em seguida, as leituras limpas são cortadas para remover as sequências do adaptador de suas extremidades. Todas as bases nas extremidades do fragmento que não ultrapassam o limite de qualidade também são cortadas.

Em seguida, uma ferramenta de montagem adequada é usada para montar as leituras em sequências contíguas - chamadas contigs - com base nos segmentos de DNA sobrepostos.

A montagem comparativa do genoma pode ser usada quando um genoma de referência de um organismo intimamente relacionado está disponível para direcionar a reconstrução do novo genoma. Aqui, as leituras são alinhadas ao genoma de referência e isso fornece um layout para outras etapas na montagem do genoma.

Alternativamente, a montagem do genoma de novo precisa ser realizada na ausência de um genoma de referência. Aqui, as leituras sobrepostas são usadas para orientar as sequências em contigs mais longos.

Na próxima etapa, as leituras curtas emparelhadas - que são leituras pendentes no final dos contigs - são usadas para estruturar o genoma.

As lacunas entre os contigs adjacentes são preenchidas com Ns no caso de sequências desconhecidas. No entanto, se leituras longas com mais de 1 kb de comprimento forem usadas para unir contigs, as lacunas poderão ser preenchidas com sequências reais.

O resultado é um genoma montado que precisa ser anotado com a ajuda de ferramentas automatizadas - um processo chamado anotação do genoma.

Os dois principais objetivos da anotação do genoma são a estrutura do gene e a previsão da função do gene, comumente conhecidas como anotação estrutural e anotação funcional, respectivamente.

Enquanto a anotação estrutural leva à identificação dos elementos genômicos, como regiões codificantes, motivos regulatórios, etc.; a anotação funcional ajuda a identificar corretamente a função biológica desses elementos estruturais, especialmente genes codificadores de proteínas.

As ferramentas de anotação do genoma usam os dados disponíveis, incluindo transcritos conhecidos, sequências de proteínas ou sinais, genes previstos de outros genomas sequenciados ou assinaturas de domínios conservados, como referências para qualquer nova anotação.

Uma vez que o software alinha esses dados disponíveis ao rascunho do genoma, eles precisam ser filtrados e polidos manualmente ou usando ferramentas de anotação para obter um conjunto final de anotações de genes.