16.11:
Genes Repórteres
Os genes repórteres são um tipo de gene codificador de proteínas que geralmente são marcados com um gene de interesse. Uma vez dentro de uma célula-alvo, os genes repórteres geralmente produzem características visualmente identificáveis, como fluorescência e luminescência, quando expressos junto com o gene de interesse. Assim, os genes repórteres “relatam” a presença ou ausência de genes de interesse em um organismo, determinam o padrão de expressão gênica ou rastreiam a localização física de um segmento de DNA ou proteína na célula.
Os genes repórteres comumente usados são – GFP (gene da proteína fluorescente verde), lacZ (gene da β-galactosidase), RFP (gene da proteína fluorescente vermelha) e Luc (gene da luciferase). As células que expressam GFP brilham em verde quando excitadas por comprimentos de onda de azul na faixa ultravioleta, enquanto aquelas que expressam RFP brilham em vermelho quando excitadas por comprimentos de onda de 488 nm ou 532 nm. As células que expressam o gene Luc produzem enzimas luciferase que catalisam uma reação com a luciferina para produzir luz. O gene lacZ é o gene repórter mais comum usado em E.coli. Produz uma enzima β-galactosidase que faz com que a bactéria pareça azul quando cultivada em um meio contendo substrato X-gal.
Além do uso de genes repórteres no estudo da expressão e localização gênica, eles também podem ajudar no estudo da força dos promotores. Isso é feito colocando um gene repórter a jusante do promotor em um plasmídeo e, em seguida, introduzindo-o na célula de mamífero. A expressão do gene repórter monitora a atividade do promotor. Se a expressão do gene repórter for alta, o promotor é considerado um promotor forte; é fraco se a expressão do gene repórter for baixa.
O gene repórter, quando colocado a jusante do promotor em um plasmídeo, também ajuda a medir a eficiência da transfecção. O plasmídeo recombinante é transfectado em uma célula de mamífero e sua expressão mostra que a célula foi transfectada com sucesso. A quantidade de proteína produzida pelo plasmídeo recombinante mostra sua eficiência de transfecção.
Os pesquisadores usam genes repórteres para determinar quando e onde um gene de interesse é expresso. Um gene repórter codifica uma proteína que pode ser rastreada, como uma proteína com atividade enzimática conhecida ou fluorescente.
A expressão gênica é controlada por sequências cis-regulatórias localizadas a montante ou a jusante da região codificadora de um gene no DNA.
O padrão e o tempo de expressão gênica podem ser determinados criando DNA recombinante com um gene repórter sob o controle de uma sequência cis-regulatória de interesse e introduzindo-o em células ou organismos.
Este gene recombinante é introduzido em diferentes tipos de células, e tanto o gene de interesse quanto o gene repórter podem se expressar.
Como o gene de interesse e o gene repórter têm a mesma sequência cis-regulatória, eles são expressos nas mesmas células e ao mesmo tempo. Assim, monitorando a expressão do gene repórter, um cientista pode rastrear onde o gene de interesse está sendo expresso.
Um dos genes repórteres bem conhecidos é aquele que codifica uma proteína chamada proteína fluorescente verde – ou GFP.
GFP foi descoberto na água-viva, Aequorea victoria. A proteína produz uma fluorescência verde sob luz ultravioleta, o que permite aos pesquisadores rastrear sua localização dentro de uma célula.
Por exemplo, para estudar a expressão de β-tubulina em C. elegans, a sequência codificadora do gene da β-tubulina foi substituída pelo gene gfp.
A expressão do gene gfp está agora sob o controle do promotor do gene da β-tubulina.
Esse DNA recombinante foi introduzido no verme usando uma microinjeção e o gene foi expresso, de forma semelhante à β-tubulina.
A localização da GFP foi monitorada por meio de microscopia de fluorescência. Como a fluorescência GFP foi mostrada nos neurônios receptores de toque, este é provavelmente um local onde a β-tubulina é expressa.
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