16.13: ChIP - Imunoprecipitação de cromatina

A imunoprecipitação da cromatina, ou ChIP, é uma técnica baseada em anticorpos usada para identificar locais no DNA que se ligam a fatores de transcrição de interesse ou proteínas histonas. Também ajuda a determinar o tipo de modificações de histonas, como acetilação, fosforilação ou metilação.

Tipos de ChIP

O ChIP pode ser dividido em dois tipos – X-ChIP e N-ChIP. O X-ChIP envolve a reticulação in vivo de histonas e proteínas reguladoras ao DNA, fragmentando o DNA por sonicação e isolando os complexos proteína-DNA imunoprecipitando-os com anticorpos específicos. Por outro lado, o N-ChIP não envolve a reticulação do DNA com as proteínas, e a digestão é realizada por meio de nucleases.

Análise a jusante das interações DNA-proteína

Depois de isolar o DNA de interesse, técnicas como PCR, microarrays ou southern blot podem ser usadas para análise. Alternativamente, esse DNA pode ser usado para sequenciamento profundo, conhecido como ChIP-Seq. O ChIP pode ser modificado usando outras metodologias para diferentes análises, como o ChIA-PET, uma técnica que combina os princípios do ChIP com a captura de conformação cromossômica para detectar interações de cromatina de longo alcance mediadas por uma proteína de interesse; enChIP, uma técnica que emprega o sistema CRISPR/Cas9 para atingir regiões genômicas específicas e RIP-ChIP/RIP-Seq, uma modificação do ChIP usada para analisar interações proteína-RNA.

Comparação entre N-ChIP e X-ChIP

N-ChIP e X-ChIP têm suas próprias vantagens e desvantagens. O N-ChIP resulta em uma ligação de anticorpos mais forte e imunoprecipitação eficiente e altamente específica. No entanto, o N-ChIP é adequado apenas no caso de proteínas fortemente ligadas, como histonas, pois os fatores de transcrição podem se separar durante o processamento. Além disso, nem toda a cromatina digerida por nuclease é solubilizada, resultando na perda de certas frações da amostra. O X-ChIP é uma excelente metodologia para estudar fatores de transcrição que não estão fortemente ligados ao DNA devido à sua etapa de reticulação. O ensaio X-ChIP também é mais sensível que o N-ChIP e requer quantidades menores de amostras e anticorpos. As desvantagens do X-chip incluem possível dificuldade de fragmentação devido ao excesso de reticulação e falsos positivos devido à reticulação de interações de proteínas de DNA transiente.