16.13: Imunoprecipitação de cromatina - ChIP

A imunoprecipitação da cromatina, ou ChIP, é uma técnica baseada em anticorpos usada para identificar locais no DNA que se ligam a fatores de transcrição de interesse ou proteínas histonas. Também ajuda a determinar o tipo de modificações das histonas, como acetilação, fosforilação ou metilação.

Tipos de Chip

O ChIP pode ser dividido em dois tipos - X-ChIP e N-ChIP. O X-ChIP envolve a ligação cruzada in vivo de histonas e proteínas reguladoras ao DNA, fragmentando o DNA por sonicação e isolando os complexos proteína-DNA por imunoprecipitação deles com anticorpos específicos. Por outro lado, o N-ChIP não envolve reticulação de DNA a proteínas e a digestão é realizada por meio de nucleases.

Análise downstream de interações DNA-proteína

Após isolar o DNA de interesse, técnicas como PCR, microarrays ou Southern Blot podem ser utilizadas para análise. Alternativamente, este DNA pode ser usado para sequenciamento profundo, conhecido como ChIP-Seq. O ChIP pode ser modificado usando outras metodologias para diferentes análises, como ChIA-PET, uma técnica que combina os princípios do ChIP com captura de conformação cromossômica para detectar interações de cromatina de longo alcance mediadas por uma proteína de interesse; enChIP, uma técnica que emprega o sistema CRISPR/Cas9 para atingir regiões genômicas específicas e RIP-ChIP/RIP-Seq, uma modificação do ChIP usada para analisar interações proteína-RNA.

Comparação entre N-ChIP e X-ChIP

N-ChIP e X-ChIP têm suas próprias vantagens e desvantagens. N-ChIP resulta em ligação mais forte de anticorpos e imunoprecipitação eficiente e altamente específica. No entanto, o N-ChIP é adequado apenas no caso de proteínas fortemente ligadas, como as histonas, pois os fatores de transcrição podem se separar durante o processamento. Além disso, nem toda a cromatina digerida com nuclease é solubilizada, resultando na perda de certas frações da amostra. X-ChIP é uma excelente metodologia para estudar fatores de transcrição que não estão fortemente ligados ao DNA devido à sua etapa de reticulação. O ensaio X-ChIP também é mais sensível que o N-ChIP e requer menores quantidades de amostras e também de anticorpos. As desvantagens do chip X incluem possível dificuldade na fragmentação devido ao excesso de reticulação e falsos positivos devido à reticulação de interações transitórias entre proteínas de DNA.

A imunoprecipitação da cromatina, abreviada como ChIP, é uma técnica para estudar as interações proteína-DNA que regulam a expressão gênica.

Nos eucariotos, o DNA é enrolado em proteínas histonas e forma um complexo conhecido como nucleossomo, que se agrupa em uma estrutura conhecida como cromatina para ajudar no empacotamento apertado do DNA nas células.

A expressão gênica é regulada por meio de modificações de histonas que desenrolam ou apertam essas estruturas, bem como proteínas que se associam a regiões cis-regulatórias no DNA.

No ChIP, a cromatina é quebrada e os anticorpos que se ligam a modificações de histonas ou proteínas reguladoras são usados para isolar as moléculas-alvo com o DNA associado.

O primeiro passo nesse processo é reticular a proteína ao DNA com a ajuda de um agente de reticulação, como o formaldeído. Isso imobiliza a proteína no DNA, marcando o local de ligação da proteína. Após a reticulação, a cromatina é mecanicamente cortada em fragmentos curtos que variam de 100 a 200 pares de bases. Esse processo é conhecido como X-ChIP.

Um método alternativo é o N-ChIP, no qual as nucleases digerem diretamente o DNA da cromatina em fragmentos curtos, sem qualquer reticulação prévia.

A imunoprecipitação é realizada pela introdução de anticorpos que têm como alvo as proteínas reguladoras na solução que contém DNA cisalhado ou digerido. Esses anticorpos estão ligados a agentes que ajudam no isolamento seletivo.

Um método comum é ligar os anticorpos a esferas magnéticas. Um ímã é usado para isolar os anticorpos junto com quaisquer moléculas ligadas.

O complexo é enxaguado para lavar quaisquer contaminantes fracamente associados. As moléculas-alvo são destacadas com a ajuda de um detergente, como o SDS.

No caso do X-ChiP, a reticulação é revertida com a ajuda de temperaturas elevadas, e os reguladores ou histonas associados são degradados com a ajuda de proteases, deixando para trás o DNA.

O sequenciamento do DNA associado pode ajudar a identificar a sequência cis-regulatória à qual a proteína de interesse estava ligada ou o gene cuja expressão é modulada por uma modificação específica da histona.