16.15:
Perfil do Ribossomo
O perfil de ribossomo ou sequenciamento de ribo é uma técnica de sequenciamento profundo que produz um instantâneo da tradução ativa em uma célula. Ele sequencia seletivamente os mRNAs protegidos pelos ribossomos para obter uma visão do cenário de tradução de uma célula em um determinado momento.
O perfil de ribossomos tem muitas aplicações, incluindo monitoramento in vivo da tradução dentro de um determinado órgão ou tipo de tecido e quantificação de novos níveis de síntese de proteínas.
A técnica ajuda a identificar quadros de leitura abertos traduzidos e descobrir novos produtos traduzidos, incluindo peptídeos curtos e isoformas de proteínas caracterizadas com funções desconhecidas. O perfil do ribossomo também ajuda a identificar vários mRNAs na célula que não são traduzidos até receberem um sinal externo.
O perfil do ribossomo enfrenta muitos desafios técnicos, como a necessidade de grandes quantidades de amostras, a confiabilidade na inibição oportuna da tradução e a contaminação por RNA.
A técnica de congelamento rápido pode superar o desafio da inibição rápida da tradução. Ajuda a capturar com eficiência a distribuição do ribossomo dentro das células em comparação com os inibidores do alongamento da tradução, como a cicloheximida.
O RNA ribossômico (rRNA) que se liga ao mRNA geralmente é removido durante o perfil do ribossomo. No entanto, às vezes alguns contaminantes de rRNA ainda são observados. Os pesquisadores usam a enzima nuclease específica duplex (DSN) para reduzir a contaminação por rRNA, isolada do hepatopâncreas do caranguejo Kamchatka, que cliva os híbridos dsDNA e DNA-RNA. Este método também é frequentemente usado para normalizar bibliotecas de cDNA antes do sequenciamento de próxima geração e o esgotamento do rRNA das bibliotecas de RNA-seq.
Outra limitação do perfil do ribossomo está na análise de dados, o que requer a experiência certa em bioinformática. Um pacote R riboSeqR é usado para superar esse problema, que fornece métodos para resolver dados de perfil ribossômico para várias amostras.
Identificar regiões em um genoma que são transcritas e traduzidas em proteínas é um passo vital para entender um genoma e sua expressão.
Isso é conseguido com uma técnica chamada perfil de ribossomo, também conhecida como ribo-seq. Ele mapeia as posições dos ribossomos no mRNA e identifica os mRNAs que estão sendo ativamente traduzidos em proteínas.
Para isolar o RNA, as células devem primeiro ser lisadas para acessar as moléculas dentro delas. O lisado é então tratado com RNases. Essas enzimas clivam os mRNAs que não são cobertos por ribossomos, deixando apenas os fragmentos de mRNA protegidos.
Os fragmentos protegidos por ribossomos são então separados dos fragmentos clivados desprotegidos usando um gradiente de sacarose.
Os ribossomos são então removidos dos fragmentos de mRNA e o RNA é convertido em DNA por RT-PCR, usando a enzima transcriptase reversa
.Em seguida, o DNA é sequenciado e mapeado no genoma de referência. Isso determina a localização exata do ribossomo ao longo de cada mRNA.
O perfil do ribossomo também pode ajudar a identificar quadros de leitura abertos não reconhecidos ou ORFs. Uma ORF é uma região do DNA entre um códon de início e um códon de parada que pode ser traduzido em proteína. Encontrar ORFs pode ser útil na identificação de novos genes.
Considere o estudo dos padrões de expressão gênica em uma linhagem celular de mamíferos. O procedimento experimental envolve a exposição das células a estímulos que podem ativar a expressão gênica e iniciar a síntese de mRNA.
Os mRNAs que estão sendo traduzidos ativamente são identificados usando o perfil do ribossomo.
Este experimento revela que o gene B está sendo traduzido, enquanto os genes A e C não.
Ele também mostra que uma pequena região adicional do genoma com cerca de cem nucleotídeos de comprimento está sendo traduzida ativamente.
Essa região não reconhecida é um quadro de leitura aberto que pode codificar uma nova proteína que é regulada positivamente pelos estímulos experimentais.
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