5.15
Perfil do Ribossomo
O perfil do ribossomo ou sequenciamento do ribossomo é uma técnica de sequenciamento profundo que produz um instantâneo da tradução ativa em uma célul…
Identificar regiões em um genoma que são transcritas e traduzidas em proteínas é um passo vital para entender um genoma e sua expressão.
Isso é conseguido com uma técnica chamada perfil de ribossomo, também conhecida como ribo-seq. Ele mapeia as posições dos ribossomos no mRNA e identifica os mRNAs que estão sendo ativamente traduzidos em proteínas.
Para isolar o RNA, as células devem primeiro ser lisadas para acessar as moléculas dentro delas. O lisado é então tratado com RNases. Essas enzimas clivam os mRNAs que não são cobertos por ribossomos, deixando apenas os fragmentos de mRNA protegidos.
Os fragmentos protegidos por ribossomos são então separados dos fragmentos clivados desprotegidos usando um gradiente de sacarose.
Os ribossomos são então removidos dos fragmentos de mRNA e o RNA é convertido em DNA por RT-PCR, usando a enzima transcriptase reversa
.Em seguida, o DNA é sequenciado e mapeado no genoma de referência. Isso determina a localização exata do ribossomo ao longo de cada mRNA.
O perfil do ribossomo também pode ajudar a identificar quadros de leitura abertos não reconhecidos ou ORFs. Uma ORF é uma região do DNA entre um códon de início e um códon de parada que pode ser traduzido em proteína. Encontrar ORFs pode ser útil na identificação de novos genes.
Considere o estudo dos padrões de expressão gênica em uma linhagem celular de mamíferos. O procedimento experimental envolve a exposição das células a estímulos que podem ativar a expressão gênica e iniciar a síntese de mRNA.
Os mRNAs que estão sendo traduzidos ativamente são identificados usando o perfil do ribossomo.
Este experimento revela que o gene B está sendo traduzido, enquanto os genes A e C não.
Ele também mostra que uma pequena região adicional do genoma com cerca de cem nucleotídeos de comprimento está sendo traduzida ativamente.
Essa região não reconhecida é um quadro de leitura aberto que pode codificar uma nova proteína que é regulada positivamente pelos estímulos experimentais.
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Q1: What is ribosome profiling and what does it measure?
Ribosome profiling, also called ribo-seq, is a deep sequencing technique that maps ribosome positions on mRNA to identify actively translated genes. It produces a snapshot of the translation landscape in a cell at any given moment by selectively sequencing mRNAs protected by ribosomes, revealing which genes are being translated into proteins.
Q2: How does ribosome profiling isolate and protect mRNA fragments?
Cells are lysed to access internal molecules, then the lysate is treated with RNases that cleave unprotected mRNAs. Ribosomes shield their bound mRNA from cleavage, leaving only ribosome-protected fragments. These protected fragments are then separated from cleaved fragments using a sucrose gradient for further analysis.
Q3: What role do open reading frames play in ribosome profiling analysis?
Ribosome profiling identifies open reading frames (ORFs), which are DNA regions between start and stop codons that can be translated into proteins. Discovering unrecognized ORFs helps identify new genes and novel proteins. In experimental studies, ribosome profiling can reveal previously unknown translated regions upregulated by specific cellular stimuli.
Q4: How is ribosomal RNA contamination addressed in ribosome profiling?
Ribosomal RNA (rRNA) that binds to mRNA is typically removed during ribosome profiling. However, rRNA contaminants sometimes persist. Researchers use the duplex-specific nuclease (DSN) enzyme, isolated from the Kamchatka crab hepatopancreas, which cleaves dsDNA and DNA-RNA hybrids to reduce rRNA contamination in samples.
Q5: What technical challenges does ribosome profiling face?
Ribosome profiling requires large sample amounts, timely translation inhibition, and managing RNA contamination. Flash-freezing efficiently captures ribosome distribution compared to elongation inhibitors like cycloheximide. Data analysis also demands bioinformatics expertise; the riboSeqR R package helps overcome this limitation by providing methods for resolving profiling data across multiple samples.
Q6: How does ribosome profiling convert mRNA to DNA for sequencing?
After ribosomes are removed from protected mRNA fragments, the RNA is converted into DNA using reverse transcriptase through RT-PCR. The resulting DNA is then sequenced and mapped onto a reference genome to determine the exact ribosome location along each mRNA molecule.
Q7: What applications does ribosome profiling have in studying gene expression?
Ribosome profiling enables in vivo monitoring of translation in specific organs or tissues and quantifies new protein synthesis levels. It discovers translated products including short peptides and protein isoforms with unknown functions. The technique also identifies mRNAs that remain untranslated until receiving external signals, revealing dynamic translation regulation.