32.8: Princípios de Cromatografia em Coluna

A técnica de cromatografia foi inventada pela primeira vez em 1901 por Michael S. Tswett, um botânico russo, para separar pigmentos vegetais usando solventes orgânicos. Além disso, em 1941, Archer John Porter Martin e R. L. M. Synge modificaram a técnica empacotando sílica gel em uma coluna. Uma mistura de aminoácidos foi então separada na coluna empacotada usando clorofórmio e uma mistura de água como fase móvel. Este foi o primeiro relatório sobre cromatografia em coluna. Atualmente, a cromatografia em coluna é uma técnica amplamente utilizada para separar vários tipos de compostos de uma mistura de amostra.

Fatores que influenciam a separação eficiente de proteínas

Vários parâmetros, como material da coluna, empacotamento e condições operacionais, como taxas de fluxo e temperatura, determinam a eficiência da separação por cromatografia em coluna.

A escolha do material, ou matriz, da coluna determina a extensão da interação com a amostra. O material da matriz deve ser compactado de maneira firme e uniforme na coluna. Bolhas de ar, detritos, partículas grandes e precipitados interferem no fluxo uniforme do solvente através da coluna, afetando sua eficiência de separação. A coluna também deve estar livre de partículas.

A amostra injetada na coluna deve estar límpida e livre de agregados que possam entupir a coluna, dificultando o fluxo do solvente. A taxa de fluxo do solvente também afeta a separação. Taxas de fluxo de solventes muito altas ou muito baixas resultam em separação ineficiente de compostos e preparações impuras. Taxas muito altas também podem perturbar o empacotamento da coluna, afetando a eficiência do processo. Além disso, a composição do tampão de eluição também é um fator importante. Ele deve ser não corrosivo e compatível com a amostra e também com o material da coluna para evitar precipitação, ou dissolução, in situ.

Outro parâmetro operacional, a temperatura, também desempenha um papel importante no processo. Ela define a estabilidade da amostra, do material da coluna e do tampão solvente. Além disso, uma temperatura constante em toda a coluna resolve os compostos com eficiência. Após completar o processo de separação, as colunas devem ser cuidadosamente lavadas passando repetidamente um solvente adequado para evitar a contaminação da amostra em execuções posteriores. Ocasionalmente, o solvente é passado em uma coluna na direção inversa para remover qualquer material obstruído.

Limitações

Embora seja uma técnica muito utilizada, o método ainda apresenta algumas limitações. É um método muito demorado, pois as taxas de fluxo precisam ser mais lentas para uma melhor resolução dos compostos. Além disso, grandes quantidades de solventes altamente puros necessários na fase móvel tornam o processo caro. Isto também aumenta o custo de aumento de escala quando são necessários rendimentos mais elevados de compostos puros.

A cromatografia em coluna é uma técnica bioquímica usada para separar compostos com base em suas propriedades físicas e químicas.

Tem dois componentes principais - a fase estacionária sólida ou a matriz e a fase móvel líquida ou o solvente.

A coluna embalada com matriz é carregada com uma amostra, como uma mistura de proteínas. O solvente é então usado para transportar a amostra através da coluna.

Dentro da coluna, a matriz atua como uma malha molecular filtrando as proteínas com base em seu tamanho ou interação com a matriz. As proteínas maiores tendem a viajar mais rápido do que as proteínas menores, resultando em uma separação baseada no tamanho.

Além disso, as proteínas em uma amostra podem interagir com a matriz. As interações fracas permitem que as proteínas passem rapidamente, enquanto as interações fortes retêm proteínas dentro da coluna.

Uma mudança gradual no pH ou força iônica do solvente altera as interações das proteínas com a matriz e ajuda a eluír as proteínas em frações separadas.