32.8: Princípios da Cromatografia em Coluna

A técnica de cromatografia foi inventada pela primeira vez em 1901 por Michael S. Tswett, um botânico russo, para separar pigmentos vegetais usando solventes orgânicos. Além disso, em 1941, Archer John Porter Martin e R. L. M. Synge modificaram a técnica embalando sílica gel em uma coluna. Uma mistura de aminoácidos foi então separada na coluna compactada usando clorofórmio e mistura de água como fase móvel. Este foi o primeiro relatório sobre cromatografia em coluna. Atualmente, a cromatografia em coluna é uma técnica amplamente utilizada para separar vários tipos de compostos de uma mistura de amostras.

Fatores que influenciam a separação eficiente de proteínas

Vários parâmetros, como material da coluna, embalagem e condições operacionais, como vazões e temperatura, determinam a eficiência da separação por cromatografia em coluna.

A escolha do material ou matriz da coluna determina a extensão da interação com a amostra. O material da matriz deve ser embalado de forma firme e uniforme na coluna. Bolhas de ar, detritos, partículas grandes e precipitados interferem no fluxo uniforme do solvente através da coluna, afetando sua eficiência de separação. A coluna deve também estar isenta de partículas.

A amostra injetada na coluna deve ser límpida e isenta de agregados que possam obstruir a coluna, dificultando o fluxo de solventes. A taxa de fluxo do solvente também afeta a separação. Taxas de fluxo muito altas ou muito baixas de solventes resultam em separação ineficiente de compostos e preparações impuras. Taxas muito altas também podem perturbar o empacotamento da coluna, afetando a eficiência do processo. Além disso, a composição do tampão de eluição também é um fator importante. Deve ser não corrosivo e compatível com a amostra e também com o material da coluna para evitar precipitação ou dissolução in situ.

Outro parâmetro operacional, a temperatura, também desempenha um papel importante no processo. Ele decide a estabilidade da amostra, material da coluna e tampão de solvente. Além disso, uma temperatura constante em toda a coluna resolve eficientemente os compostos. Após a conclusão do processo de separação, as colunas devem ser lavadas completamente, passando repetidamente um solvente adequado para evitar a contaminação da amostra em outras execuções. Ocasionalmente, o solvente é passado em uma coluna na direção inversa para remover qualquer material entupido.

Limitações

Embora seja uma técnica muito utilizada, o método ainda apresenta algumas limitações. É um método muito demorado, pois as taxas de fluxo precisam ser mais lentas para melhor resolução dos compostos. Além disso, grandes quantidades de solventes altamente puros necessários na fase móvel tornam o processo caro. Isso também aumenta o custo de aumento quando são necessários rendimentos mais altos de compostos puros.

A cromatografia em coluna é uma técnica bioquímica usada para separar compostos com base em suas propriedades físicas e químicas.

Tem dois componentes principais - a fase estacionária sólida ou a matriz e a fase móvel líquida ou o solvente.

A coluna embalada com matriz é carregada com uma amostra, como uma mistura de proteínas. O solvente é então usado para transportar a amostra através da coluna.

Dentro da coluna, a matriz atua como uma malha molecular filtrando as proteínas com base em seu tamanho ou interação com a matriz. As proteínas maiores tendem a viajar mais rápido do que as proteínas menores, resultando em uma separação baseada no tamanho.

Além disso, as proteínas em uma amostra podem interagir com a matriz. As interações fracas permitem que as proteínas passem rapidamente, enquanto as interações fortes retêm proteínas dentro da coluna.

Uma mudança gradual no pH ou força iônica do solvente altera as interações das proteínas com a matriz e ajuda a eluír as proteínas em frações separadas.