32.5: Homogeneização de Tecidos e Lise Celular

A homogeneização de tecidos envolve a desintegração da arquitetura do tecido e a lise de células, e é um passo inicial no isolamento e análise de componentes celulares. O método utilizado para homogeneização depende do tipo de amostra, da quantidade de amostra disponível, do analito a ser obtido e da sensibilidade do método. Esses métodos são amplamente classificados como métodos mecânicos e não mecânicos.

Métodos mecânicos de homogeneização de tecidos

Esses métodos dependem da aplicação de força física externa para romper tecidos e células. Eles utilizam ferramentas e instrumentos especializados para homogeneização. Esses instrumentos usam trituração, cisalhamento, mistura, batida ou choque para desintegrar a amostra. Por exemplo, numa prensa francesa, a amostra é empurrada através de uma pequena abertura sob pressão, o que provoca a ruptura das células. Outros homogeneizadores, como misturadores Waring e rotor-estatores, cortam e cisalham os tecidos em tamanhos significativamente menores.

Métodos não mecânicos de homogeneização de tecidos

Os métodos de lise não mecânica envolvem rupturas químicas em vez de forças físicas para lisar as células. O tecido é homogeneizado em um tampão de lise que regula o pH, a força iônica, a força osmótica e a atividade enzimática. O tampão de lise auxilia assim a lise celular e protege os componentes celulares contra danos.

Enquanto as enzimas do tampão de lise ajudam a degradar a matriz extracelular dos tecidos para liberar células individuais, o surfactante, ou detergente, ajuda a romper as membranas celulares e desnaturar as proteínas. O dodecilsulfato de sódio (SDS) e o Triton-X 100 são dois detergentes popularmente usados nesses tampões. Outro componente, os caótropos, perturbam as interações fracas entre as moléculas, desnaturando assim as proteínas e mantendo os ácidos nucleicos intactos durante o isolamento.

Outros métodos físicos não mecânicos envolvem o uso de ciclos de temperatura nos quais a amostra é congelada em gelo seco, ou em banho de etanol, e depois descongelada à temperatura ambiente, ou 37°C. Esses ciclos repetidos fazem com que as membranas celulares enfraqueçam e se rompam. As membranas celulares também podem ser rompidas por desequilíbrio osmótico, colocando-as em uma solução hipotônica ou hipertônica. O movimento para dentro, ou para fora, da água devido ao gradiente osmótico faz com que as células inchem e rebentem, ou encolham e colapsem, liberando o seu conteúdo interno.

Embora vários métodos e ferramentas estejam disponíveis para homogeneização, cada um tem prós e contras que devem ser avaliados com base nos requisitos específicos. Frequentemente, os métodos mecânicos por si só podem não homogeneizar total ou eficientemente uma amostra. Nesses casos, os métodos mecânicos podem ser combinados com métodos não mecânicos para homogeneização completa.

As técnicas de homogeneização tecidual interrompem a arquitetura do tecido e lisam as células para isolar organelas subcelulares ou macromoléculas, como ácidos nucléicos e proteínas.

Dependendo da amostra e da aplicação a jusante pretendida, a homogeneização pode ser realizada usando métodos mecânicos ou não mecânicos.

Métodos mecânicos de base sólida, como um triturador de tecido ou batedor de contas, são usados para amostras de tecido duro ou fibroso, como osso e músculo.

Enquanto um moedor de lenços de papel usa um almofariz e pilão operados manualmente ou automaticamente para moer uma amostra, o batedor de grânulos usa a colisão entre a amostra e os grânulos para quebrar o tecido.

A ultrassonografia é um método de homogeneização mecânica à base de líquido que pode cisalhar células em suspensão usando ondas sonoras de alta frequência geradas por uma sonda vibratória.

As técnicas não mecânicas incluem métodos de homogeneização enzimática, biológica ou química.

Estes incluem o uso de coquetéis enzimáticos contendo colagenase ou tripsina ou agentes químicos como detergentes ou caotrópicos, ciclos de congelamento e descongelamento ou osmose para romper a parede celular e a membrana plasmática e liberar o conteúdo da célula na solução.

Os métodos não mecânicos são frequentemente combinados com a lise mecânica para obter os melhores resultados