O estudo do comportamento locomotor complexos em<em> Drosophila melanogaster</em> Depende da capacidade de quantificar as mudanças no movimento de uma mosca dado. Este artigo demonstra como fazer isso usando um sistema de rastreamento de alta resolução.
Moscas fornecer um importante modelo para estudar o comportamento complexo devido à multiplicidade de ferramentas genéticas disponíveis para pesquisadores da área. Estudar o comportamento locomotor em<em> Drosophila melanogaster</em> Depende da capacidade de ser capaz de quantificar as mudanças no movimento durante ou em resposta a uma dada tarefa. Por esta razão, uma de alta resolução sistema de monitoramento de vídeo, como a que descrevemos neste artigo, é uma valiosa ferramenta para medir locomoção em tempo real. Nosso protocolo envolve o uso de um pulso de ar inicial para quebrar o ímpeto moscas, seguido por um período de filmagem trigésimo segundo em uma câmara quadrados. Um programa de rastreamento é então usado para calcular a velocidade instantânea de cada voar dentro da câmara em incrementos de 10 ms. Software de análise, em seguida, compila estes dados, e saídas de uma variedade de parâmetros como velocidade média, velocidade máxima, tempo gasto em movimento, aceleração, etc Este protocolo irá discutir alimentação adequada e manejo de moscas para tarefas comportamentais, manuseio voa sem anestesiados ou imobilização , a criação de um ambiente controlado, e correndo o ensaio do início ao fim.
Parte 1: Alimentação e Gestão de moscas
Parte 2: Configurando o sistema de rastreamento em um ambiente controlado
Parte 3: Disponibilizar voa para a câmara de locomoção
Parte 4: Executando o Ensaio Locomotor
Parte 5: Análise de Vídeos
Resultados representativos:
A Figura 1 mostra os vestígios de organismos representativos tipo selvagem Canton S (Figura 1, painel esquerdo) e moscas nulo para o gene dCASK que foram gerados pelo cruzamento de duas grandes deleções sobrepostas (Df (3R) X307 e Df (3R) x313) (Figura 1 , à direita do painel). moscas nula dCASK já sido demonstrado que têm problemas de locomoção usando Paradigma de Buridan 3, e no nosso paradigma, em comparação com Canton S, eles mostram grande diminuição de locomoção. Corremos sempre organismos do tipo selvagem para ter certeza de que as condições e comportamento estão dentro da faixa normal em um determinado dia. Temos observado desvios padrão respostas em menos de 5% dos dias de testes. Essas diferenças podem normalmente ser atribuídas a problemas com os parâmetros de nosso ambiente controlado.
Figura 1. DIAS gerado traços de ambos Canton S moscas do tipo selvagem (acima, à esquerda) e Locomotor deficiente Null dCASK moscas gerados a partir de exclusões sobrepostas (acima, à direita). Os traços representam o que é visto nos vídeos gravados. Ambos os traços imagens contrain 8-10 moscas executado por 30 segundos no teste de monitoramento de vídeo após um pulso de ar.
Figura 2. Moscas tipo selvagem foram executados no ensaio locomotor (acima), após um pulso de ar (barras de roxo) e sem um pulso de ar (azul). Em todos os parâmetros calculados pelo programa de análise, não houve diferenças significativas entre as duas condições (determinado com bicaudal estudante t-teste). Isso demonstra que, após um pulso de ar, voa locomover normalmente em nossa configuração.
Em nossa configuração, um pulso de ar moderadamente forte transitoriamente pára movimento voar. Quando o pulso de ar termina, as moscas são liberados a partir deste estado estacionário e locomover normalmente, como mostrado na figura 2. Porque este pulso de ar efetivamente sincroniza a locomoção da população, nós usá-lo para iniciar o estudo para que possamos também estudar o início do movimento após um estímulo impulso quebrar. O ensaio pode, no entanto, ser feito sem um pulso de ar desde parâmetros de locomoção após o início não são afetados pelo pulso de ar (Figura 2).
Um problema frequente visto com análise automatizada de locomoção é a questão das colisões. Programas de rastreamento são, na maior parte notoriamente ruim em lidar com as moscas que se chocam. Esses programas muitas vezes perdem "visão" de um objeto momentaneamente durante uma colisão, e ao encontrar este rótulo objeto como um objeto novo. O resultado pode ser uma saída que tem muitos mais objetos traçado do que realmente existe na câmara. Muitas pessoas resolver este problema, traçando moscas único. O problema óbvio com este, no entanto, é que o comportamento única mosca pode ser muito diferente do que o comportamento da população devido ao papel dos sinais sociais, em Drosophila comportamento e locomoção 4. Isto é, claro, não necessariamente uma coisa ruim, dependendo do que você está tentando estudar, mas para nossos propósitos, nós preferimos usar as populações de moscas para aumentar nosso poder estatístico. Devido a isso, lidamos com colisões de duas maneiras. Primeiro, só usamos 10/08 moscas por julgamento (no nosso 56 milímetros quadrados de câmara), para que as colisões serão mínimas. Em segundo lugar, dentro de nossos trinta ensaios segundo, nós só analisar os traços que são pelo menos 18 segundos de duração. Ao fazer isso, estamos sempre de tempo de gravação suficiente para capturar ataques múltiplos de movimento em sua totalidade. Isso também garante que o tamanho da amostra sempre reflete o número de moscas em uma câmara, como fragmentos menores do movimento são descartados eo comprimento total do vídeo é de apenas 30 segundos.
A análise dos dados pode ser a parte mais difícil de todo este processo. O passo mais importante de analisar dados de monitoramento é determinar a diferença entre o ruído e movimento. DIAS (como muitos outros programas) quase nunca uma velocidade de saída de 0 mm / s, mesmo se a mosca parou de se mover. Devido a isso, é importante assistir a vídeos enquanto olha para o quadro de saída de dados por quadro para ver quando os organismos estão realmente em movimento, e quando eles não são. Em nossa configuração, todas as velocidades abaixo de 1 mm / s parecem ser ruído, o que é consistente com o que outros grupos usando DIAS encontrei com moscas adultas 1. Para olhar para a dinâmica da estrutura de combate, é preciso também definir uma luta. Nós definimos a atividade como 3 ou mais quadros consecutivos de velocidade acima de 1 mm / s, e inatividade como 3 ou mais quadros consecutivos abaixo deste limiar.
Os dados devem também ser devidamente alisado para eliminar os artefatos de cintilação de luz transiente e distorções da câmera, que ocorrem ocasionalmente. Não existe um método padrão para dados de alisamento, mas é importante que o processo de alisamento não muda a tendência geral dos dados demasiado drástica, ou se pode gerar artefatos de alisamento. Nós suave duas vezes com uma janela de Tukey "5,15,60,15,5", porque parece eliminar quaisquer grandes saltos ou mudanças de velocidade que são claramente errado, mas não muda a tendência geral ou a natureza dos dados.
É importante reconhecer que as configurações e ambientes diferentes podem produzir diferentes resultados comportamentais. Nossa recomendação para qualquer criação de um ensaio de monitoramento é a experiência com todas estas questões até encontrar um método que produz dados que corresponde ao que pode ser visto visualmente, e, então, ser o mais consistente possível no tratamento de todos os dados da mesma maneira.
Seleção do programa de rastreamento direito também é importante. Apesar de usarmos DIAS 3,2 (www.solltechnologies.com), este não é de forma melhor ou o único sistema disponível. Para rastreamento de moscas único, Dan Valente (Mitra Lab, CSHL) desenvolveu um programa chamado FTrack. Para moscas locomoting múltiplas juntas (ou seja, onde pode ocorrer colisões), Kristin Branson (Dickinson / Perona Labs, Caltech) desenvolveu um programa chamado Ctrax. FTrack está disponível em www.chronux.org, enquanto Ctrax está disponível em www.dickinson.caltech.edu / Research / Mtrax. Ethovision software (Noldus, Países Baixos) é outra opção poderosa disponível para monitoramento de vídeo de moscas tanto simples e múltiplas, mas é apenas comercialmente disponíveis, e é muito caro.
Se você configurou um ensaio de rastreamento e não consegue registos fiáveis, há algumas coisas a considerar. Questões do ritmo circadiano são muitas vezes um grande problema. Ao executar os testes de comportamento, deve-se sempre certificar-se de não correr moscas durante o seu meio-dia siesta. Uma vez que estamos currently interessados em genes que podem produzir diminui no comportamento locomotor, preferimos correr voa perto do pico no final da tarde de atividade (ZT 8-10). Outro problema também pode surgir de fluxo de ar inconsistente da fonte. Antes de ensaios de partida, não se esqueça de testar o fluxo de ar com o medidor de vazão, de modo que ele não vai variar enormemente com o pulso de ar de 15 segundos. Por fim, os antecedentes genéticos podem desempenhar um papel em todas as tarefas comportamentais, então alguns dos parâmetros deste ensaio podem precisar de ser otimizado para um fundo particular.
Square Chamber | Tool | Machine Shop | N/A | Design from Wolf <em>et al.</em> 2002<sup>1</sup> |
Digital Camera | Camera | Sharp | ViewcamZ VL-23 | |
Flowmeter | Tool | Cole-Parmer | SY-32003-12 | |
Light Box | Tool | DNASTAR | Seq-Easy | |
Charcoal Filter | Tool | Fisher Scientific | 09-744-37 | |
DIAS 3.2 | Software | Soll technologies | N/A | www.solltechnologies.com |