É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.

Summary

O estudo do comportamento locomotor complexos em<em> Drosophila melanogaster</em> Depende da capacidade de quantificar as mudanças no movimento de uma mosca dado. Este artigo demonstra como fazer isso usando um sistema de rastreamento de alta resolução.

Abstract

Moscas fornecer um importante modelo para estudar o comportamento complexo devido à multiplicidade de ferramentas genéticas disponíveis para pesquisadores da área. Estudar o comportamento locomotor em<em> Drosophila melanogaster</em> Depende da capacidade de ser capaz de quantificar as mudanças no movimento durante ou em resposta a uma dada tarefa. Por esta razão, uma de alta resolução sistema de monitoramento de vídeo, como a que descrevemos neste artigo, é uma valiosa ferramenta para medir locomoção em tempo real. Nosso protocolo envolve o uso de um pulso de ar inicial para quebrar o ímpeto moscas, seguido por um período de filmagem trigésimo segundo em uma câmara quadrados. Um programa de rastreamento é então usado para calcular a velocidade instantânea de cada voar dentro da câmara em incrementos de 10 ms. Software de análise, em seguida, compila estes dados, e saídas de uma variedade de parâmetros como velocidade média, velocidade máxima, tempo gasto em movimento, aceleração, etc Este protocolo irá discutir alimentação adequada e manejo de moscas para tarefas comportamentais, manuseio voa sem anestesiados ou imobilização , a criação de um ambiente controlado, e correndo o ensaio do início ao fim.

Protocol

Parte 1: Alimentação e Gestão de moscas

1. Moscas devem ser cultivadas em frascos contendo levedura livre de mídia padrão. Você vai precisar de um grande número de moscas, por isso atravessa precisa ser configurado de acordo. Moscas devem ser cultivadas em uma de 12 horas luz: ciclo escuro a 25 º C.
2. Moscas devem ser coletadas logo após a eclosão (1-3 dias). Moscas podem ser trabalhados com nesta fase usando um difusor de dióxido de carbono, e devem ser classificados em tubos de ensaio contendo meio autoclavado ou yeast-free. Usamos somente machos, armazenados de 10 a um tubo de ensaio.
3. Permitir que pelo menos um ou dois dias após o uso de dióxido de carbono antes de executar os experimentos comportamentais. Corremos voa em nosso ensaio comportamental 3-5 dias após a eclosão.
4. Ensaios deve ser sempre feito dentro da mesma janela de tempo de 2-3 horas por dia para evitar problemas de ritmo circadiano.

Parte 2: Configurando o sistema de rastreamento em um ambiente controlado

1. Todos os experimentos são feitos em uma sala de ambiente que mantém uma temperatura constante de 25 º C com umidade de 70%.
2. Suspender uma câmera de vídeo digital sobre a área a ser gravada (câmera virada para baixo). Desde o nosso software de rastreamento é baseado em contraste, nós suspendemos a câmera sobre uma caixa de luz. Registros os vídeos da câmera diretamente em um computador Dell através de uma conexão firewire. Nós usamos uma câmera de vídeo da Sharp digital, ligado a um computador Dell com o Windows Moviemaker (versão Vista) para aquisição de vídeo.
3. Pulsos de ar será administrado nesse protocolo, portanto, uma fonte de fluxo de ar deve estar presente na sala. Usando tubos de borracha, conecte a fonte de ar para um filtro de carbono para a filtração de ar.
4. Usando tubos de borracha mais, conecte o outro lado do filtro de carbono para um Erlenmeyer através de uma rolha de borracha oco, e encher o balão com cerca de meia polegada de água. Isto irá umidificar o ar.
5. O frasco também deve ter uma arma, que vai ligar a uma válvula em forma de Y através de tubos de borracha.
6. Um ramo do Y-válvula deve ser conectada a um fluxômetro. O outro ramo deve fornecer ar à câmara de locomoção quadrados.

Parte 3: Disponibilizar voa para a câmara de locomoção

1. A câmara de locomoção quadrado é baseado no projeto de Wolf et al. 2002 ^1, com a adição de bandejas pequena queda para impedir que as moscas de voar dentro da câmara. A câmara deve ser desmontado, e todos os componentes devem ser cuidadosamente limpo com álcool 70% e secadas antes de usar.
2. Anestesia imediatamente antes de realizar um ensaio de comportamento pode comprometer o desempenho. Para evitar isso, as moscas são gentilmente bateu para dentro da câmara usando um funil com uma pequena saída. Para fazer uma tomada do tamanho certo, coloque uma ponteira azul (para P1000) até o fim de um funil. Use uma tesoura para cortar o final da ponta da pipeta para fazer a abertura grande o suficiente para uma mosca passar.
3. No topo da nossa câmara é um pequeno pedaço de plexiglass garantidos por parafusos em torno das bordas. Quando os parafusos são removidos, os buracos podem ser usados ​​para entregar voa para a câmara. Posicione a parte superior de acrílico para que o orifício do parafuso fica diretamente sobre a câmara interna em vez de um parafuso, onde normalmente se senta. Pegue um tubo de ensaio contendo as moscas e colocá-lo de cabeça para baixo sobre o funil, que deve então ser colocado no orifício do parafuso.
4. Não mova o funil, pois isso poderia prejudicar ou danificar as moscas. Em vez disso, gentilmente bater toda a câmara, funil e todos, até que todas as moscas estão no interior da câmara. Este batendo deve ser feito em um mouse pad para absorver o choque deste batendo. Quando as moscas estão dentro, remova o funil, e re-posição superior a plexiglass sobre as camas parafuso. Em seguida, re-parafuso superior do plexiglass no lugar.

Parte 4: Executando o Ensaio Locomotor

1. Uma vez que as moscas são devidamente carregado, deixá-los se aclimatar na câmara por 30 minutos. Este período de aclimatação deve ocorrer em ambiente controlado (25 º C, umidade 70%), ea câmara deve ser colocada no topo da caixa de luz (que deve ser ligado). Acender as luzes outro quarto fora.
2. Após o período de aclimatação, mudar o Y-válvula no sistema de fluxo de ar de tal forma que o ar só de fluxo para o medidor de vazão. Ligue o ar, o ar e rampa até a velocidade desejada (4,0-6,0 L / min). Geralmente usamos 5,0-5,5 L / min, mas qualquer velocidade nessa faixa vai funcionar.
3. Uma vez que a velocidade desejada seja atingida, mudar o Y-válvula de modo que o ar flui para a câmara de locomoção. Esse tempo de pulso de ar por 15 segundos, e então abruptamente desligar o ar desligado. Como ligar o ar desligado, ligue a câmera ao modo de gravação. (Esta parte requer prática para fazer todas de uma vez).
4. Parar a gravação após a hora desejada e SAVE. Nós registramos 30 ensaios segundo em 10 quadros por segundo (pelo menos 8 ensaios por genótipo).

Parte 5: Análise de Vídeos

1. Usamos oSistema de Análise de dinâmica de imagem (DIAS) software 3.2 para o movimento de rastreamento ^2. , A fim de usar este software, primeiro converter os nossos vídeos para um formato de arquivo AVI com o Quicktime 7.5.5.
2. Para acompanhar as moscas com base em contrário, usamos o "AutoTrace pela Threshold" função. Em seguida, usamos o "Caminho Faça da Trace" função para digitalizar esses traços.
3. Para a saída a velocidade instantânea de cada voar, usamos o "Compute Parâmetros" função de produzir um arquivo de banco de dados (DIAS-específicas). Usando esta função, também suavizar a dados usando um "5,15,60,15,5" Tukey Janela Smoothing.
4. Uma vez que esta informação é passada como um arquivo de banco de dados, ele pode ser aberto no Microsoft Excel. Nós usamos um script Matlab para compilar as velocidades instantânea dentro de excel e calcular parâmetros necessários para a compreensão dinâmica do movimento e da estrutura luta.

Resultados representativos:

A Figura 1 mostra os vestígios de organismos representativos tipo selvagem Canton S (Figura 1, painel esquerdo) e moscas nulo para o gene dCASK que foram gerados pelo cruzamento de duas grandes deleções sobrepostas (Df (3R) X307 e Df (3R) x313) (Figura 1 , à direita do painel). moscas nula dCASK já sido demonstrado que têm problemas de locomoção usando Paradigma de Buridan ^3, e no nosso paradigma, em comparação com Canton S, eles mostram grande diminuição de locomoção. Corremos sempre organismos do tipo selvagem para ter certeza de que as condições e comportamento estão dentro da faixa normal em um determinado dia. Temos observado desvios padrão respostas em menos de 5% dos dias de testes. Essas diferenças podem normalmente ser atribuídas a problemas com os parâmetros de nosso ambiente controlado.

Figura 1. DIAS gerado traços de ambos Canton S moscas do tipo selvagem (acima, à esquerda) e Locomotor deficiente Null dCASK moscas gerados a partir de exclusões sobrepostas (acima, à direita). Os traços representam o que é visto nos vídeos gravados. Ambos os traços imagens contrain 8-10 moscas executado por 30 segundos no teste de monitoramento de vídeo após um pulso de ar.

Figura 2. Moscas tipo selvagem foram executados no ensaio locomotor (acima), após um pulso de ar (barras de roxo) e sem um pulso de ar (azul). Em todos os parâmetros calculados pelo programa de análise, não houve diferenças significativas entre as duas condições (determinado com bicaudal estudante t-teste). Isso demonstra que, após um pulso de ar, voa locomover normalmente em nossa configuração.

Discussion

Em nossa configuração, um pulso de ar moderadamente forte transitoriamente pára movimento voar. Quando o pulso de ar termina, as moscas são liberados a partir deste estado estacionário e locomover normalmente, como mostrado na figura 2. Porque este pulso de ar efetivamente sincroniza a locomoção da população, nós usá-lo para iniciar o estudo para que possamos também estudar o início do movimento após um estímulo impulso quebrar. O ensaio pode, no entanto, ser feito sem um pulso de ar desde parâmetros de locomoção após o início não são afetados pelo pulso de ar (Figura 2).

Um problema frequente visto com análise automatizada de locomoção é a questão das colisões. Programas de rastreamento são, na maior parte notoriamente ruim em lidar com as moscas que se chocam. Esses programas muitas vezes perdem "visão" de um objeto momentaneamente durante uma colisão, e ao encontrar este rótulo objeto como um objeto novo. O resultado pode ser uma saída que tem muitos mais objetos traçado do que realmente existe na câmara. Muitas pessoas resolver este problema, traçando moscas único. O problema óbvio com este, no entanto, é que o comportamento única mosca pode ser muito diferente do que o comportamento da população devido ao papel dos sinais sociais, em Drosophila comportamento e locomoção ^4. Isto é, claro, não necessariamente uma coisa ruim, dependendo do que você está tentando estudar, mas para nossos propósitos, nós preferimos usar as populações de moscas para aumentar nosso poder estatístico. Devido a isso, lidamos com colisões de duas maneiras. Primeiro, só usamos 10/08 moscas por julgamento (no nosso 56 milímetros quadrados de câmara), para que as colisões serão mínimas. Em segundo lugar, dentro de nossos trinta ensaios segundo, nós só analisar os traços que são pelo menos 18 segundos de duração. Ao fazer isso, estamos sempre de tempo de gravação suficiente para capturar ataques múltiplos de movimento em sua totalidade. Isso também garante que o tamanho da amostra sempre reflete o número de moscas em uma câmara, como fragmentos menores do movimento são descartados eo comprimento total do vídeo é de apenas 30 segundos.

A análise dos dados pode ser a parte mais difícil de todo este processo. O passo mais importante de analisar dados de monitoramento é determinar a diferença entre o ruído e movimento. DIAS (como muitos outros programas) quase nunca uma velocidade de saída de 0 mm / s, mesmo se a mosca parou de se mover. Devido a isso, é importante assistir a vídeos enquanto olha para o quadro de saída de dados por quadro para ver quando os organismos estão realmente em movimento, e quando eles não são. Em nossa configuração, todas as velocidades abaixo de 1 mm / s parecem ser ruído, o que é consistente com o que outros grupos usando DIAS encontrei com moscas adultas ^1. Para olhar para a dinâmica da estrutura de combate, é preciso também definir uma luta. Nós definimos a atividade como 3 ou mais quadros consecutivos de velocidade acima de 1 mm / s, e inatividade como 3 ou mais quadros consecutivos abaixo deste limiar.

Os dados devem também ser devidamente alisado para eliminar os artefatos de cintilação de luz transiente e distorções da câmera, que ocorrem ocasionalmente. Não existe um método padrão para dados de alisamento, mas é importante que o processo de alisamento não muda a tendência geral dos dados demasiado drástica, ou se pode gerar artefatos de alisamento. Nós suave duas vezes com uma janela de Tukey "5,15,60,15,5", porque parece eliminar quaisquer grandes saltos ou mudanças de velocidade que são claramente errado, mas não muda a tendência geral ou a natureza dos dados.

É importante reconhecer que as configurações e ambientes diferentes podem produzir diferentes resultados comportamentais. Nossa recomendação para qualquer criação de um ensaio de monitoramento é a experiência com todas estas questões até encontrar um método que produz dados que corresponde ao que pode ser visto visualmente, e, então, ser o mais consistente possível no tratamento de todos os dados da mesma maneira.

Seleção do programa de rastreamento direito também é importante. Apesar de usarmos DIAS 3,2 (www.solltechnologies.com), este não é de forma melhor ou o único sistema disponível. Para rastreamento de moscas único, Dan Valente (Mitra Lab, CSHL) desenvolveu um programa chamado FTrack. Para moscas locomoting múltiplas juntas (ou seja, onde pode ocorrer colisões), Kristin Branson (Dickinson / Perona Labs, Caltech) desenvolveu um programa chamado Ctrax. FTrack está disponível em www.chronux.org, enquanto Ctrax está disponível em www.dickinson.caltech.edu / Research / Mtrax. Ethovision software (Noldus, Países Baixos) é outra opção poderosa disponível para monitoramento de vídeo de moscas tanto simples e múltiplas, mas é apenas comercialmente disponíveis, e é muito caro.

Se você configurou um ensaio de rastreamento e não consegue registos fiáveis, há algumas coisas a considerar. Questões do ritmo circadiano são muitas vezes um grande problema. Ao executar os testes de comportamento, deve-se sempre certificar-se de não correr moscas durante o seu meio-dia siesta. Uma vez que estamos currently interessados ​​em genes que podem produzir diminui no comportamento locomotor, preferimos correr voa perto do pico no final da tarde de atividade (ZT 8-10). Outro problema também pode surgir de fluxo de ar inconsistente da fonte. Antes de ensaios de partida, não se esqueça de testar o fluxo de ar com o medidor de vazão, de modo que ele não vai variar enormemente com o pulso de ar de 15 segundos. Por fim, os antecedentes genéticos podem desempenhar um papel em todas as tarefas comportamentais, então alguns dos parâmetros deste ensaio podem precisar de ser otimizado para um fundo particular.

Materials

Square Chamber	Tool	Machine Shop	N/A	Design from Wolf <em>et al.</em> 2002<sup>1</sup>
Digital Camera	Camera	Sharp	ViewcamZ VL-23
Flowmeter	Tool	Cole-Parmer	SY-32003-12
Light Box	Tool	DNASTAR	Seq-Easy
Charcoal Filter	Tool	Fisher Scientific	09-744-37
DIAS 3.2	Software	Soll technologies	N/A	www.solltechnologies.com