De alta resolução de vídeo de Rastreamento Locomotion em Adult Drosophila melanogaster

Summary

O estudo do comportamento locomotor complexos em Drosophila melanogaster Depende da capacidade de quantificar as mudanças no movimento de uma mosca dado. Este artigo demonstra como fazer isso usando um sistema de rastreamento de alta resolução.

Abstract

Moscas fornecer um importante modelo para estudar o comportamento complexo devido à multiplicidade de ferramentas genéticas disponíveis para pesquisadores da área. Estudar o comportamento locomotor em

Protocol

Parte 1: Alimentação e Gestão de moscas

1. Moscas devem ser cultivadas em frascos contendo levedura livre de mídia padrão. Você vai precisar de um grande número de moscas, por isso atravessa precisa ser configurado de acordo. Moscas devem ser cultivadas em uma de 12 horas luz: ciclo escuro a 25 º C.
2. Moscas devem ser coletadas logo após a eclosão (1-3 dias). Moscas podem ser trabalhados com nesta fase usando um difusor de dióxido de carbono, e devem ser classificados em tubos de ensaio contendo meio autoclavado ou yeast-free. Usamos somente machos, armazenados de 10 a um tubo de ensaio.
3. Permitir que pelo menos um ou dois dias após o uso de dióxido de carbono antes de executar os experimentos comportamentais. Corremos voa em nosso ensaio comportamental 3-5 dias após a eclosão.
4. Ensaios deve ser sempre feito dentro da mesma janela de tempo de 2-3 horas por dia para evitar problemas de ritmo circadiano.

Parte 2: Configurando o sistema de rastreamento em um ambiente controlado

1. Todos os experimentos são feitos em uma sala de ambiente que mantém uma temperatura constante de 25 º C com umidade de 70%.
2. Suspender uma câmera de vídeo digital sobre a área a ser gravada (câmera virada para baixo). Desde o nosso software de rastreamento é baseado em contraste, nós suspendemos a câmera sobre uma caixa de luz. Registros os vídeos da câmera diretamente em um computador Dell através de uma conexão firewire. Nós usamos uma câmera de vídeo da Sharp digital, ligado a um computador Dell com o Windows Moviemaker (versão Vista) para aquisição de vídeo.
3. Pulsos de ar será administrado nesse protocolo, portanto, uma fonte de fluxo de ar deve estar presente na sala. Usando tubos de borracha, conecte a fonte de ar para um filtro de carbono para a filtração de ar.
4. Usando tubos de borracha mais, conecte o outro lado do filtro de carbono para um Erlenmeyer através de uma rolha de borracha oco, e encher o balão com cerca de meia polegada de água. Isto irá umidificar o ar.
5. O frasco também deve ter uma arma, que vai ligar a uma válvula em forma de Y através de tubos de borracha.
6. Um ramo do Y-válvula deve ser conectada a um fluxômetro. O outro ramo deve fornecer ar à câmara de locomoção quadrados.

Parte 3: Disponibilizar voa para a câmara de locomoção

1. A câmara de locomoção quadrado é baseado no projeto de Wolf et al. 2002 ^1, com a adição de bandejas pequena queda para impedir que as moscas de voar dentro da câmara. A câmara deve ser desmontado, e todos os componentes devem ser cuidadosamente limpo com álcool 70% e secadas antes de usar.
2. Anestesia imediatamente antes de realizar um ensaio de comportamento pode comprometer o desempenho. Para evitar isso, as moscas são gentilmente bateu para dentro da câmara usando um funil com uma pequena saída. Para fazer uma tomada do tamanho certo, coloque uma ponteira azul (para P1000) até o fim de um funil. Use uma tesoura para cortar o final da ponta da pipeta para fazer a abertura grande o suficiente para uma mosca passar.
3. No topo da nossa câmara é um pequeno pedaço de plexiglass garantidos por parafusos em torno das bordas. Quando os parafusos são removidos, os buracos podem ser usados ​​para entregar voa para a câmara. Posicione a parte superior de acrílico para que o orifício do parafuso fica diretamente sobre a câmara interna em vez de um parafuso, onde normalmente se senta. Pegue um tubo de ensaio contendo as moscas e colocá-lo de cabeça para baixo sobre o funil, que deve então ser colocado no orifício do parafuso.
4. Não mova o funil, pois isso poderia prejudicar ou danificar as moscas. Em vez disso, gentilmente bater toda a câmara, funil e todos, até que todas as moscas estão no interior da câmara. Este batendo deve ser feito em um mouse pad para absorver o choque deste batendo. Quando as moscas estão dentro, remova o funil, e re-posição superior a plexiglass sobre as camas parafuso. Em seguida, re-parafuso superior do plexiglass no lugar.

Parte 4: Executando o Ensaio Locomotor

1. Uma vez que as moscas são devidamente carregado, deixá-los se aclimatar na câmara por 30 minutos. Este período de aclimatação deve ocorrer em ambiente controlado (25 º C, umidade 70%), ea câmara deve ser colocada no topo da caixa de luz (que deve ser ligado). Acender as luzes outro quarto fora.
2. Após o período de aclimatação, mudar o Y-válvula no sistema de fluxo de ar de tal forma que o ar só de fluxo para o medidor de vazão. Ligue o ar, o ar e rampa até a velocidade desejada (4,0-6,0 L / min). Geralmente usamos 5,0-5,5 L / min, mas qualquer velocidade nessa faixa vai funcionar.
3. Uma vez que a velocidade desejada seja atingida, mudar o Y-válvula de modo que o ar flui para a câmara de locomoção. Esse tempo de pulso de ar por 15 segundos, e então abruptamente desligar o ar desligado. Como ligar o ar desligado, ligue a câmera ao modo de gravação. (Esta parte requer prática para fazer todas de uma vez).
4. Parar a gravação após a hora desejada e SAVE. Nós registramos 30 ensaios segundo em 10 quadros por segundo (pelo menos 8 ensaios por genótipo).

Parte 5: Análise de Vídeos

1. Usamos oSistema de Análise de dinâmica de imagem (DIAS) software 3.2 para o movimento de rastreamento ^2. , A fim de usar este software, primeiro converter os nossos vídeos para um formato de arquivo AVI com o Quicktime 7.5.5.
2. Para acompanhar as moscas com base em contrário, usamos o "AutoTrace pela Threshold" função. Em seguida, usamos o "Caminho Faça da Trace" função para digitalizar esses traços.
3. Para a saída a velocidade instantânea de cada voar, usamos o "Compute Parâmetros" função de produzir um arquivo de banco de dados (DIAS-específicas). Usando esta função, também suavizar a dados usando um "5,15,60,15,5" Tukey Janela Smoothing.
4. Uma vez que esta informação é passada como um arquivo de banco de dados, ele pode ser aberto no Microsoft Excel. Nós usamos um script Matlab para compilar as velocidades instantânea dentro de excel e calcular parâmetros necessários para a compreensão dinâmica do movimento e da estrutura luta.

Resultados representativos:

A Figura 1 mostra os vestígios de organismos representativos tipo selvagem Canton S (Figura 1, painel esquerdo) e moscas nulo para o gene dCASK que foram gerados pelo cruzamento de duas grandes deleções sobrepostas (Df (3R) X307 e Df (3R) x313) (Figura 1 , à direita do painel). moscas nula dCASK já sido demonstrado que têm problemas de locomoção usando Paradigma de Buridan ^3, e no nosso paradigma, em comparação com Canton S, eles mostram grande diminuição de locomoção. Corremos sempre organismos do tipo selvagem para ter certeza de que as condições e comportamento estão dentro da faixa normal em um determinado dia. Temos observado desvios padrão respostas em menos de 5% dos dias de testes. Essas diferenças podem normalmente ser atribuídas a problemas com os parâmetros de nosso ambiente controlado.

Figura 1. DIAS gerado traços de ambos Canton S moscas do tipo selvagem (acima, à esquerda) e Locomotor deficiente Null dCASK moscas gerados a partir de exclusões sobrepostas (acima, à direita). Os traços representam o que é visto nos vídeos gravados. Ambos os traços imagens contrain 8-10 moscas executado por 30 segundos no teste de monitoramento de vídeo após um pulso de ar.

Figura 2. Moscas tipo selvagem foram executados no ensaio locomotor (acima), após um pulso de ar (barras de roxo) e sem um pulso de ar (azul). Em todos os parâmetros calculados pelo programa de análise, não houve diferenças significativas entre as duas condições (determinado com bicaudal estudante t-teste). Isso demonstra que, após um pulso de ar, voa locomover normalmente em nossa configuração.

Discussion

Em nossa configuração, um pulso de ar moderadamente forte transitoriamente pára movimento voar. Quando o pulso de ar termina, as moscas são liberados a partir deste estado estacionário e locomover normalmente, como mostrado na figura 2. Porque este pulso de ar efetivamente sincroniza a locomoção da população, nós usá-lo para iniciar o estudo para que possamos também estudar o início do movimento após um estímulo impulso quebrar. O ensaio pode, no entanto, ser feito sem um pulso de ar desde parâmetros de locomoção após o...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ferramenta	de Câmara Quadrada	Oficina de Máquina	N / A	Design de Wolf et al.< / em> 20021< / sup>
Câmera	Digital	Sharp	ViewcamZ VL-23
Ferramenta de medidor de vazão		Cole-Parmer	SY-32003-12
Ferramenta de caixa de luz		DNASTAR	Seq-Easy
Filtro de carvão	Ferramenta	Fisher Scientific	09-744-37
DIAS 3.2	Software	Soll technologies	N/A	www.solltechnologies.com