De alta resolução de vídeo de Rastreamento Locomotion em Adult Drosophila melanogaster

No ensaio de rastreamento de vídeo, as moscas devem ser carregadas em uma câmara de observação quadrada sem o uso de anestesia. Para fazer isso, um pequeno funil deve ser alinhado com orifícios de parafusos na câmara, de modo a derrubar as moscas na câmara. Usando este funil, os parafusos selam os orifícios da câmara e um pulso de ar é administrado através das saídas de ar para iniciar a locomoção.

Uma câmera de vídeo suspensa acima da câmara, capta essa locomoção e a envia para um computador onde os caminhos das moscas são traçados e analisados. Olá, sou Justin Slawson, do Griffith Lab aqui no Departamento de Biologia da Brandeis University. Hoje vamos mostrar um procedimento para rastreamento de vídeo de locomoção em alta resolução.

Vamos usar esse procedimento em nosso laboratório para estudar o comportamento locomotor em moscas adultas. Então vamos começar. Para começar o experimento, cultive moscas e garrafas contendo mídia padrão sem fermento.

Este protocolo requer um grande número de moscas, portanto, os cruzamentos precisam ser configurados de acordo. As moscas devem ser cultivadas em um ciclo claro escuro de 12 horas a 25 graus Celsius. Colete as moscas um a três dias após Aus: use um difusor de dióxido de carbono para classificar as moscas em tubos de ensaio contendo meios livres de fermento, classifique 10 machos por tubo de ensaio.

Espere pelo menos um ou dois dias após o uso de dióxido de carbono antes de executar os experimentos comportamentais. Uma vez que as moscas tenham sido coletadas e classificadas, elas podem ser executadas no sistema de rastreamento de vídeo. Os experimentos de rastreamento de vídeo são feitos em uma sala ambiente, que mantém uma temperatura constante de 25 graus Celsius com 70% de umidade.

Para filmar moscas em movimento, você precisará suspender uma câmera de vídeo digital sobre a área a ser gravada. Com a câmera voltada para baixo, suspendemos a câmera sobre uma caixa de luz, pois nosso software de rastreamento é baseado em contraste. Em seguida, usando um cabo de fio de fogo, conecte a câmera a um computador.

Usamos o programa de software, Windows Movie Maker para gravar o vídeo diretamente no computador. Como os pulsos de ar serão administrados neste protocolo, uma fonte de fluxo de ar deve estar presente na sala. Tubos de borracha conectam a fonte de ar a um filtro de carbono para filtragem de ar.

O tubo de borracha também conecta o outro lado do filtro de carbono a um frasco erlenmeyer por meio de uma rolha de borracha oca. O frasco deve ser preenchido com cerca de meia polegada de água, o que umidificará o ar. O frasco também deve ter uma pequena pistola, que deve ser conectada a uma válvula em forma de Y por meio de mais tubos de borracha.

Um ramo da válvula Y se conecta a um medidor de vazão, enquanto o outro ramo se conecta à câmara de locomoção quadrada. Esta câmara de locomoção quadrada é baseada no design da Wolf Etal 2002 com a adição de pequenas bandejas de queda para evitar que as moscas voem dentro da câmara antes de conectar a câmara ao sistema de rastreamento, lembre-se de usar 70% de etanol para esterilizar todos os componentes da câmara. Deixe os componentes acionarem antes de usar.

Agora que o sistema de rastreamento está pronto, podemos entregar as moscas na câmara de locomoção para entregar as moscas na câmara. Remova os parafusos que normalmente mantêm a pequena parte superior de plexiglass da câmara segura. Em seguida, posicione a parte superior de plexiglass de forma que o orifício do parafuso fique diretamente sobre a câmara interna.

Anestesiar as moscas imediatamente antes de conduzir. Um ensaio comportamental pode comprometer o desempenho. Para evitar a anestesia, use um funil com uma pequena saída para derrubar suavemente as moscas na câmara.

Para fazer um funil com uma pequena saída, prenda uma ponta de pipeta azul P 1000 na extremidade do funil. Use uma tesoura para cortar a ponta da pipeta para tornar a abertura grande o suficiente para a passagem de uma mosca. Em seguida, pegue um tubo de ensaio contendo as moscas e coloque-o de cabeça para baixo sobre o funil.

Em seguida, coloque a extremidade do funil no orifício do parafuso. Não mova o funil, pois isso pode machucar ou danificar as moscas. Em vez disso, bata suavemente em todo o funil da câmara e tudo até que todas as moscas estejam dentro da câmara.

Use um mouse pad para absorver o choque dessa batida. Quando as moscas estiverem dentro, remova o funil e reposicione a tampa de plexiglass sobre as camas de parafuso e, em seguida, coloque a tampa de plexiglass no lugar. Assim que as moscas estiverem devidamente carregadas, coloque a câmara em cima de uma caixa de luz.

Apague as outras luzes da sala ambiente e deixe as moscas se aclimatarem na câmara por 30 minutos. Após o período de aclimatação de 30 minutos, prossiga com o ensaio locomotor para iniciar o ensaio. Troque a válvula Y no sistema de fluxo de ar de forma que o ar flua apenas para o medidor de vazão, ligue o ar e acelere o ar até a velocidade desejada.

Qualquer velocidade dentro de quatro a seis litros por minuto funcionará. Geralmente usamos de cinco a cinco litros e meio por minuto. Uma vez atingida a velocidade do ar desejada, troque a válvula Y para que o ar flua para a câmara de locomoção.

Cronometre esse pulso de ar por 15 segundos e, em seguida, desligue abruptamente o ar ao desligá-lo. Mude a câmera para o modo de gravação. Esta etapa requer prática para fazer tudo de uma vez.

Registramos 32ª tentativas a 10 quadros por segundo e pelo menos oito tentativas por genótipo. Pare a gravação quando o teste estiver concluído e certifique-se de salvar o filme quando os testes forem concluídos. Podemos prosseguir com a análise de vídeo para realizar o rastreamento de movimento dos vídeos do ensaio locomotor.

Usamos o sistema de análise dinâmica de imagens para usar este software. Converta os vídeos para um formato de arquivo A VI com o QuickTime 7.5 0.5. Em seguida, use a função de rastreamento automático por limite para rastrear as moscas com base no contraste, seguida pelo caminho de criação da função de rastreamento para digitalizar.

Esses rastreamentos aplicam a função de parâmetros de computação para gerar as velocidades instantâneas de cada mosca em um arquivo de banco de dados. Esta função também permite a suavização de dados. Usamos uma janela de alisamento 5 15 60 15 5.

Depois que essas informações são geradas como um arquivo de banco de dados, abrimos e salvamos os arquivos no Microsoft Excel. Os arquivos do Excel são processados usando um script MATLAB para compilar as velocidades instantâneas e calcular parâmetros adicionais necessários para entender a dinâmica do movimento. E estrutura de luta.

Aqui está um resultado representativo deste ensaio. A figura à esquerda mostra vestígios de organismos de Cantão do tipo selvagem, enquanto a figura à direita mostra moscas nulas para o gene dake, que foram geradas pelo cruzamento de duas grandes deleções sobrepostas. Como você pode ver em nosso paradigma, as moscas nulas Dask mostram uma locomoção muito diminuída em comparação com o Cantão S, o que já foi relatado na literatura usando um tipo diferente de ensaio locomotor.

Acabamos de mostrar como configurar e executar um ensaio de rastreamento de vídeo locomotor. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de realizar os ensaios dentro da mesma janela de tempo de duas a três horas todos os dias para evitar problemas de ritmo circadiano e sempre executar organismos do tipo selvagem primeiro para garantir que as respostas comportamentais estejam dentro da faixa normal em um determinado dia. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.