Summary
인플루엔자 바이러스의 게놈은 RNA와 단백질 여덟 별도 단지, 칭했다 바이러스성 ribonucleoprotein 컴플렉스 (vRNPs)로 구성되어 있습니다. 본 논문은 글리세롤 기울기 정화 및 독감 vRNPs의 전송 전자 현미경의 시각화에 대해 설명합니다.
Abstract
인플루엔자 바이러스 게놈은 개별적으로 바이러스성 ribonulceoprotein 입자 (vRNPs)에 인플루엔자 핵 단백질 (NP)의 복사본이 여러 개 모여 팔 부정적 - 감각, 단일 좌초 RNA 분자로 이루어져 있습니다. 인플루엔자 vRNPs는 바이러스 봉투 안에 동봉됩니다. 그들이 호스트 핵 수송 기계에 액세스할 어디 셀 항목 동안 그러나, 이러한 vRNP의 단지는 세포질에 발표됩니다. 인플루엔자 vRNPs 및 인플루엔자 게놈의 복제의 핵 수입을 연구하기 위해서는, 그것은 바이러스의 다른 구성 요소가 이러한 프로세스를 방해하지 않도록 격리 vRNPs 작동하는 데 유용합니다. 여기, 우리는 인플루엔자 바이러스로부터 vRNPs 정화 절차를 설명합니다. 절차는 싸여 virion에서 vRNP 단지를 공개하기 위해 인플루엔자 세제과 virion의 장애로 시작합니다. vRNPs은 다음 인플루엔자 속도 침강에 의해 33~70% 불연속 글리세롤 기울기에 virion의 다른 구성 요소에서 분리됩니다. 글리세롤 기울기에서 얻은 분수는 다음 쿠매시과 청색의 얼룩 후 SDS - PAGE를 통해에서 분석하고 있습니다. NP가 포함된 정상 분수 그런 다음 함께 풀링 및 원심 분리에 의해 집중되고있다. 농도 후 vRNPs의 무결성은 부정적인 얼룩 후 전송 전자 현미경에 의해 vRNPs의 시각화에 의해 확인됩니다. 글리세롤 기울기 정화는 Kemler에게서의 수정입니다
Protocol
1 부 : 인플루엔자의 파괴 Virion
- 베크맨 옵티마에서 사용할 TLA - 120.2 로터에 맞게 설계된 하나 베크맨 폴리 카보 네이트 원심 분리기 튜브 (11mm X 34mm)로 MNT 버퍼의 750 μl (20 MM MES, 150 MM NaCl, 30 MM 트리스, 산도 7.5)를 추가 최대 - E의 초원 심 분리기.
- 그 튜브로, 인플루엔자 바이러스 (2 MG / ML H3N2 X - 31 A/AICHI/68 변형) 500 μl를 추가합니다. 몇 시간을 아래와 pipetting하여 MNT 버퍼와 바이러스를 섞는다.
- TLA - 120.2 로터를 사용하여 베크맨 옵티마 최대 - E의 원심 분리기에서 109,000 XG, 4 ° C에서 10 분 원심 분리기.
- 뜨는을 제거하고 500 μl 중단 버퍼의 펠릿 (100 MM KCl, 5 MM MgCl 2, 5 % (W / V) 글리세롤, 50 MM의 octylglucoside, 10 MG / ML lysolecithin, 1.5 MM dithiothreitol, 100 MM MES를 resuspend 산도 5.5).
- 와동 적극적으로, 그리고 31 흔들 ° C를 eppendorf thermomixer에 20 분.
2 부 : 글리세롤 기울기 세디먼트 속도 원심 분리
- 1 ML 70% (V / V) 글리세롤, 0.75 ML 50 % 글리세롤, 0.375 ML 40 % 글리세롤, 그리고 1.8 : 베크맨 ultraclear의 원심 분리기 튜브 (13mm X 51mm)를로 글리세롤의 다음과 같은 금액을 배치하여 글리세롤 기울기 준비 ML 33 % 글리세롤. 글리세롤 솔루션은 NM 버퍼 (150 MM NaCl, 50 MM MES, 산도 5.5)와 순수한 글리세롤을 혼합하여 만들어집니다. 또한 글리세롤과 버퍼를 모두 포함하는 균형 튜브를 준비합니다.
- 소용돌이 다시 바이러스 샘플을 중단하고, 글리세롤 기울기에 그것을로드합니다.
- 베크맨 MLS - 50 스윙 - 물통 회전자에 217,000 XG, 4 ° C에서 3.75 시간 동안 그라데이션을 원심 분리기.
- 원심 분리가 완료되면 수동으로 튜브의 상단에서 시작 그라디언트 250 μl aliquots를 수집합니다. ° C. 얼음이나 4 분수 유지
파트 3 : SDS의 Polyacrylamide 젤 전기 영동에 의해 글리세롤의 그라데이션 분수 분석
- 각 분획에서 신선한 튜브 20 μl를 제거합니다.
- 5 배 SDS - PAGE 샘플 버퍼의 5 μl를 추가합니다.
- 95 열 ° C 5 분.
- 간단히 샘플을 스핀 다운하고 10 % polyacrylamide 젤로 그들을로드하고, 우물 중 하나 분자량 마커를 포함합니다.
- bromphenol 블루 로딩 염료가 젤 하단에 가까운 도달 때까지 겔에서 샘플을 실행합니다.
- 쿠매시과 청색의 젤 얼룩.
파트 4 : vRNP 분수의 농도
- 주로 NP가 들어있는 글리세롤의 분수를 선택, 그들을 결합, 두 베크맨 폴리 카보 네이트 원심 분리기 튜브 (11mm X 34mm)로 그들을 배포합니다.
- 디에틸 pyrocarbonate (DEPC) 처리된 Ultrapure 물, 그리고 pipet 위아래 섞어 여러 번 각 튜브를 입력합니다.
- 베크맨 TLA - 120.2 로터에 157,000 XG, 4 ° C에서 4.5 시간 동안 원심 분리기.
- 뜨는을 제거하고, DEPC - 처리된 물을 50 μl의 펠렛을 resuspend.
- 원하는 경우, 집중 vRNPs의 280도 측정할 수 있습니다. NP는 풀링된 분수의 주요 구성 요소 존재로서, NP의 molarity의 견적가 55,350 자사의 흡광 계수 M -1 cm -1 (같은 ProtParam 3를 통해 결정)를 사용하여 계산하실 수 있습니다.
- 나누어지는 정화 vRNPs을하고, 그들 ° C 나중에 사용하기 위해 -80에서 냉동 보관합니다.
제 5 부 : vRNPs의 음성 스테 이닝
- 9 μl로 정화 vRNP 1 μl를 희석 갓 만든 여과 - 두 번 MNT 버퍼 (20 MM MES, 150 MM NaCl, 30 MM 트리스, 산도 7.5). 다른 버퍼는 또한 vRNPs을 희석하고 표본 그리드 (단계 5.5) 씻어 확인을하지만, uranyl 아세테이트가 부정적인 얼룩에 사용하는 경우 PBS를 사용하지 마십시오.
- 30 초 동안 parlodion 탄소 필름으로 이전 코팅 글로우 방전 표본 (구리 TEM)은 그리드.
- 핀셋으로 신선한 형광 방전 표본 격자를 보유하고 표본 격자에 희석 vRNP의 5 μl 드롭을 적용합니다.
- 팔분을위한 그리드에 시편의 드롭를 남겨주세요.
- 기다리는 동안 벤치에 Parafilm의 작은 스트립을 배치, 10 μl MNT 버퍼의 각 (격자를 씻어), 그리고 갓 만든 얼룩 솔루션의 80 μl 드롭 (1 % 암모늄 molybdate 또는 1을 포함하는 두 방울을 분배 Parafilm에 %의 uranyl 아세테이트).
- 흡착의 8 분 후에, 필터 종이로 표본 그리드 (삼각형으로 잘라)에서 샘플 솔루션의 일부를 심지. 표본의 격자가 건조시키지 마십시오.
- 일분의 총 시간을위한 10 μl MNT 버퍼를 각각 포함하는 두 방울의 표본 격자를 씻으십시오. 이것은 신중하게 드롭에 표본 그리드를 낮추고, 그리고 필터 종이로 표본 그리드 (표본 그리드 건조 아무말도없이)에서 샘플 솔루션의 일부를 위킹 통해 이루어집니다.
- 즉시 표본 격자에서 버퍼의 마지막 한 방울을 위킹 후, 완료정의 잠수함은 표본의 얼룩 비말 내에서 격자 1 잠깐 만요.
- 완전 필터 종이로 표본 그리드에서 얼룩 솔루션을 심지.
- 전송 전자 현미경으로 관찰하기 전에 몇 분 동안 공기 건조 표본의 격자를 허용합니다.
6 부 : 대표 결과 :
그림 1
독감 NP (~ 56 KDA)와 같은 바이러스성 ribonucleoprotein의 단지에있는 주요 단백질은, NP 밴드는 일반적으로 vRNPs (그림 1)이있는 분수에서 가장 강한 밴드이다. NP 이외에도, 각 인플루엔자 vRNP 또한 trimeric RNA 효소 (82, 86 및 86.5 KDA의 분자 가중치) 복합의 사본을 포함하고 있습니다. 이것은 수 또는 풍부가 낮은 NP의 비교이기 때문에 쿠매시 푸른 얼룩으로 표시되지 않을 수 있습니다. polymerases 그러나, 대신에 얼룩 Commassie 파란색의 경우, 은색이 젤이 수행되는 중 얼룩 검색하실 수 있습니다. 독감 매트릭스 단백질 M1은 (~ 28 KDA) NP 단백질 피크 분수가 존재하는 분수에 최소한 존재해야합니다.
그림 2
전송 전자 현미경 하에서 시각으로 부정 묻은 vRNPs 길이가 120 나노미터 (그림 2A)에 약 30 nm의 아르 가변 길이 막대 모양의 입자 유사 vRNPs를 얻을 것입니다. oligomeric NP가 더욱 더블 헬리컬 반복 구조로 접혀 있습니다 NP 분자의 체인으로 구성되어 있습니다, 이러한 막대 모양의 입자 중 하나를 끝에 고리 때로는 (그림 2B) 볼 수 있습니다.
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Discussion
vRNPs의 정화가 Kemler 외. (1994)에 기술된 절차에 따라 달라집니다. 한 우리는 다른 사람들이 그들이 핵 수입을 공부 vRNPs을 분리하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다. 2,4,5
우리는 바이러스 게놈은 RNA로 구성되어 있기 때문에 RNase 무료 도움말 및 vRNPs을 조작 튜브의 사용을 권장하고, 따라서 RNA의 존재에서 쉽게 떨어집니다. 또한, 모든 버퍼는 RNase 무료입니다 물에하여야한다. 프로토콜은 산성 추출 (예 중단 버퍼와 글리세롤 기울기의 산도는 5.5)으로 수행되었습니다 여기에 설명되어 있습니다. 마찬가지로, 기본 추출는 MES, 트리스, pH를 7.8로 산도 5.5를 대체하여 (같은 Kemler 외. (1994) 1 설명) 수행할 수 있습니다.
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Acknowledgments
이 작품은 혁신에 대한 캐나다 재단 (CFI), 보건 연구 (CIHR)의 캐나다 연구소와 자연 과학 및 캐나다 공학 연구 협의회 (NSERC)에서 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H3N2 X-31 A/AICHI/68 influenza A | Charles River Laboratories | 490715 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M-8250 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-1 | |
| Octylglucoside | Sigma-Aldrich | O-8001 | |
| Lysolecithin | Sigma-Aldrich | L-4129 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D-9779 | |
| Coomassie brilliant blue G-250 | Kodak | 1367796 | |
| diethyl pyrocarbonate (DEPC)-treated water | Invitrogen | 750024 | |
| Uranyl Acetate | Ted Pella, Inc. | 19481 | |
| Ammonium Molybdate | Fisher Scientific | A-674 | |
| Optima MAX-E Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | 434491 | |
| MLS-50 Rotor Package, Swinging Bucket | Beckman Coulter Inc. | 367280 | |
| TLA-120.2 Rotor Assembly, Fixed-Angle, Titanium | Beckman Coulter Inc. | 362046 | |
| Eppendorf Thermomixer | Lauda Brinkmann | 022670000 |
References
- Kemler, I., Whittaker, G., Helenius, A. Nuclear import of microinjected influenza virus ribonucleoproteins. Virology. 202, 1028-1033 (1994).
- Wu, W. W. H., Weaver, L. L., Panté, N. Ultrastructural analysis of the nuclear localization sequences on influenza a ribonucleoprotein complexes. J Mol Biol. 374, 910-916 (2007).
- Gasteiger, E. The Proteomics Protocols Handbook. Walker, J. M. , Humana Press. 571-607 (2005).
- Wu, W. W. H., Sun, Y. H. B., Panté, Nuclear import of influenza A viral ribonucleoprotein complexes is mediated by two nuclear localization sequences on viral nucleoprotein. Virol J. 4, 49-49 (2007).
- Babcock, H. P., Chen, C., Zhuang, X. Using single-particle tracking to study nuclear trafficking of viral genes. Biophys J. 87, 2749-2758 (2004).
