Aqui demonstramos microinjeção citoplasmática de Xenopus laevis Oócitos com um substrato de importação nuclear, bem como a preparação dos oócitos injetados para visualização por thin-corte de microscopia eletrônica.
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Artigo de método
Microinjeção de Oócitos Xenopus laevis
Neste artigo
Resumo
Resumo
Microinjeção de oócitos Xenopus laevis seguido por thin-corte de microscopia eletrônica (EM) é um excelente sistema para estudar o transporte nucleocytoplasmic. Por causa de seu grande núcleo e alta densidade dos complexos de poro nuclear (NPCs), o transporte nuclear pode ser facilmente visualizado no oócito Xenopus. Visão muito sobre os mecanismos de importação e exportação nuclear foi adquirida através do uso deste sistema (revisado por Pante, 2006). Além disso, temos utilizado microinjeção de oócitos Xenopus para dissecar as vias de importação nuclear de vários vírus que se replicam no núcleo host.
Aqui demonstramos a microinjeção citoplasmática de oócitos Xenopus com um substrato importação nuclear. Mostramos também a preparação dos oócitos injetados para visualização por thin-corte EM, incluindo dissecção, desidratação e incorporação dos oócitos em uma resina epóxi incorporação. Finalmente, fornecemos resultados representativos para oócitos que foram microinjeções do capsídeo do baculovírus nucleopoliedrovirus Autographa californica (AcMNPV) ou o vírus da parvovirose Minuto de Ratos (MVM), e discutir possíveis aplicações da técnica.
Protocolo
Parte 1: Preparação de ovócitos para Xenopus microinjeção
- Coloque um pedaço pequeno (cerca de 2 cm) de Xenopus ovário laevis em um tubo de 50 ml cônico contendo 20 ml de colagenase solução (5 mg / ml de colagenase em cálcio livre modificado Barth salina: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM MgSO 4, 10 mM Hepes, pH 7,5). Colagenase é usado para remover as células do folículo que cercam os oócitos.
- Colocar o tubo em uma plataforma shaker e rock-a gentilmente (a 100 RPM) por uma hora. Esse tempo varia com diferentes lotes de colagenase. Assim, após uma hora, dê uma pequena amostra de oócitos e examiná-las sob um micros....
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Discussão
Microinjeção de oócitos Xenopus combinado com thin-corte EM é uma ferramenta altamente eficaz para estudar o transporte nucleocytoplasmic. Este sistema tem sido usado para mapear etapas distintas de importação através do NPC, por exemplo, a interação de um substrato de importação nuclear com componentes estruturais do NPC, tais como os filamentos citoplasmáticos e cesta nuclear (revisado por Pante, 2006). Também tem sido usado para estudar a importação nuclear nuclear de replicar-vírus (Pante e Kann, 2002; Rabe.......
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Agradecimentos
Agradecemos a David Theilmann (Pacific Agri-Food Research Centre, Summerland, British Columbia) para fornecer o baculovírus AcMNPV e para a discussão útil.
Este trabalho foi financiado por doações da Fundação Canadense para a Inovação (CFI), o Canadian Institutes of Health Research (CIHR), a Fundação Michael Smith para Pesquisa em Saúde (MSFHR), e as Ciências Naturais e Pesquisa de Engenharia Council of Canada (NSERC) .
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Referências
- Panté, N. Use of intact Xenopus oocytes in nucleocytoplasmic transport studies. Methods Mol. Biol. 322, 301-314 (2006).
- Panté, N., Kann, M. Nuclear pore complex is able to transport macromolecules with diameters of about 39 nm. Mol. Biol. Cell
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Reimpressões e permissões
