Artigo de método

Gibberella zeae produção de ascósporos e Coleta de Experimentos de Microarray.

DOI:

10.3791/115

⸱

30 de novembro de 2006

 , 
1Cereal Disease Laboratory, USDA, 2University of Minnesota/ Agroinnova, University of Torino, 3Cereal Disease Laboratory, University of Minnesota

Neste artigo

Resumo

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Para estudar os processos de desenvolvimento de ascósporos em Gibberella zeae, um procedimento de coleta em condições estéreis é filmado de forma a gerar o maior nível de informação para a descrição do protocolo. Isso deve facilitar a reprodutibilidade do experimento, um aspecto crucial quando completa do genoma testes perfil de expressão são implementadas.

Resumo

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Fusarium graminearum Schwabe (teleomorfo Gibberella zeae) é um patógeno de plantas que causam a doença em crosta de trigo e cevada, que reduz rendimento da colheita e qualidade de grãos. F. graminearum também provoca caule e ouvido rots de milho e é um produtor de micotoxinas, como a tricotecenos que contaminam grãos e são prejudiciais para seres humanos e animais (Goswami e Kistler, 2004). O fungo produz dois tipos de esporos. Ascósporos, os propágulos resultante da reprodução sexual, são a principal fonte de infecção primária. Esses esporos são forçosamente alta peritécios maduros e dispersos pelo vento (Francl et al 1999). Infecções secundárias são causadas principalmente por macroconídios que são produzidos por meio assexuada na superfície da planta. Para estudar os processos de desenvolvimento de ascósporos no este fungo, um procedimento para a sua coleção em grande quantidade em condições de esterilidade era necessário. Nosso protocolo foi filmado a fim de gerar o maior nível de informação para a compreensão e reprodutibilidade; aspectos cruciais quando completa do genoma perfis de expressão gênica são geradas e interpretadas. Em particular, a variabilidade de germinação ascósporos e atividade biológica são dependentes da manipulação prévia do material. O uso de vídeo para documentar cada passo na produção de ascósporos é proposto, a fim de aumentar a padronização, cumprindo com as exigências cada vez mais rigorosas para a análise de microarray. O procedimento requer apenas equipamentos de laboratório padrão. Etapas são mostradas para evitar a contaminação e sincronização favor época de ascósporos.

Protocolo

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  1. Ágar cenoura (Klittich e Leslie, 1988) foi preparado em 9 cm de diâmetro pratos de Petri.
  2. Um cubo 2 mm de ágar contendo micélio fresco cultivados em ágar batata dextrose foi aplicada para o centro de cada placa de Petri.
  3. Culturas foram cultivadas a 25 ° C e um fotoperíodo de 12 h para 96 ​​hrs.
  4. Um ml de solução aquosa 2,5% Tween 60 foi aplicado à superfície da cultura (Trail e Common, 2000) e se espalhou pela a cultura com uma haste de plástico, pressionando suavemente.
  5. Tiro peritécio ascósporos desenvolvido 7-10 dias após este tratamento de indução quando mantidos em um ambiente de alta umidade a 25 ° C com o fotoperíodo mesmo.
  6. Coleta de Spore é realizada alterando a tampa placa de Petri, deixando peritécio para disparar por um tempo limitado (por exemplo 12 horas) no escuro.
  7. Água estéril é adicionado à tampa, suspendendo ascósporos delicadamente movendo água na superfície.
  8. Ascósporos são coletadas em tubos estéreis, Falcon, lavada e usada para análise posterior.

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Discussão

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O protocolo apresentado aqui é baseado em procedimentos anteriores utilizados para a produção perithecial para Fusarium spp. (Klittich e Leslie, 1988; Trail e Common, 2000). Padronização do procedimento pelo qual uma grande quantidade de ascósporos (suficiente para a análise de microarray) foram gerados foi essencial para a reprodutibilidade do experimento. Tem sido relatado que as diferenças fatores ambientais, idade e substrato pode mudar o caráter biológico de ascósporos (Beyer e Verreet, 2005). Portanto, o uso do vídeo pode destacar peq...

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Agradecimentos

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Os autores agradecem a Karen Hilburn para excelente suporte técnico. Este projecto foi apoiado pela Iniciativa Nacional de Pesquisa do Estado Cooperative Research USDA, Educação e Serviço de Extensão (Award # 2004-35604-14327). Matias Pasquali é apoiada por Branco Weiss Fellowship. O trigo dos EUA e Iniciativa Scab Cevada também é reconhecido pelo apoio permanente de pesquisa.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa de Petri 9 cm de diâmetroFerramenta
Tween 60 (20%)Reagente
Ágar cenoura (20% p/v cenouras orgânicas e 1,5% p/v ágar) Reagente

Referências

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  1. Beyer, M., Verreet, J. A. Germination of Gibberella zeae ascospores as affected by age of spores after discharge and environmental factors. , (2005).
  2. Francl, L., Shaner, G., Bergstrom, G., Gilbert, J., Pedersen, W., Dill-Macky, R., Sweets, L., Corwin, B., Jin, Y., Gallenberg, D., Wiersma, J. Daily inoculum levels of Gibberella zeae on wheat spikes. Plant Disease 83,662-666. , (1999).
  3. Goswami, R. S., Kistler, H. C. Heading for disaster, Fusarium graminearum on cereal crops. Molecular Plant Pathology 5,515–525. , (2004).
  4. Klittich, C. J. R., Leslie, J. F. Nitrate reduction mutants in Fusarium moniliforme (Gibberella fujikuroi. Genetics. 118, 417-2013 (1998).
  5. Trail, F., Common, R. Perithecium development in Gibberella zeae, a light microscopy study. , (2000).
  6. Tschantz, A. T., Horst, R. L., Nelson, P. E. A substrate for uniform production of perithecia in Gibberella zeae. Mycologia. , 67-1101 (1975).
  7. Tschanz, A. T., Horst, R. K., Nelson, P. E. The effect of environment on sexual reproduction of Gibberella zeae. , (1976).

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Etiquetas

Fungal SporesSpore CollectionSterile ConditionsPerithecia DischargeWheat PathogenBarley InfectionMaize Contamination

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