Visualizando o Live Drosophila Junção neuromuscular-Glial com corantes fluorescentes

Resumo

Descrevemos as características estruturais das sinapses Glia-neuromuscular em um romance de preparação dos tecidos dentro para fora-de larvas de moscas ao vivo usando corantes fluorescentes com microscopia confocal. Nós rotulados terminais de neurônios fluorescentes viver com anticorpos primários para HRP, e também visualizar o espaço perisynaptic com Dextranos fluorescente.

Resumo

Nosso projeto identificou GFP rotulados estruturas glial no desenvolvimento larval sinapse neuromuscular voar. Olhar para o desenvolvimento de viver glial-nervo-músculo sinapses, desenvolvemos uma preparação do tecido larval que tinham características de larvas intactas ao vivo, mas também teve boas propriedades ópticas. Esta nova preparação também permitiu o acesso de perfusato para a sinapse. Usamos larvas de moscas, imersa-los em hemolinfa artificial, e relaxaram seus normais contrações rítmicas do corpo de arrefecimento-los. Em seguida, dissecados fora os segmentos posterior de cada animal e com um alfinete de inseto blunt empurrou a partes da boca para trás através da cavidade do corpo. Este evertido da parede do corpo larval, como transformar uma meia dentro para fora. Concluímos a dissecção com tesoura ultra-fina dissecação e, portanto, expostos ao lado visceral dos músculos da parede do corpo. As estruturas glial no MNJ expressa GFP membrana alvo sob o controle de promotores glial específico. A membrana pós-sináptica, a SSR (Reticula subsináptico) no músculo expressa sinapticamente alvo dsRed. Precisávamos aguda rótulo os terminais do neurônio motor, a terceira parte da sinapse. Para fazer isso, aplicamos anticorpos primários para HRP, conjugado a um flurophore emitindo far-vermelho. Para testar as propriedades de difusão de corante no espaço perisynaptic entre os terminais do neurônio motor e da SSR, aplicou-se uma solução de moléculas grandes Dextran conjugado com muito vermelho flurophore emissora e imagens recolhidas.

Protocolo

Parte 1: Preparação do tecido

1. Nosso objetivo é uma preparação de tecidos de larvas de moscas, onde o sistema nervoso está intacta, mas a superfície interior do músculo parede do corpo é exposto a uma hemolinfa artificial, e pode ser posicionada perto de uma lamínula de microscópio de ótica bom. Em outras palavras, uma de dentro para fora preparação larval.
   
   Desde preparações de tecido convencional envolvem corte, prendendo e alongamento do músculo parede do corpo e, por vezes retirando parte do sistema nervoso, precisávamos de uma abordagem diferente.
   
   Queríamos que os animais de dentro para fora, porque queríamos dar uma boa olhada....

Discussão

Este procedimento permite a longo prazo de imagens ao vivo de proteínas etiquetadas e processos celulares. O tecido em prep situ descrevemos tem um SNC intacto e em funcionamento, PNS e circuitos reflexos. Esta preparação do tecido tem vantagens sobre protocolos padrão voar larval muscular, onde o músculo da parede do corpo larval é esticada (quando ele é preso para fora). Alongamento pode distorcer a morfologia sináptica e desencadear reflexo contrações based. Nossa preparação foi dentro para fora mec.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
HL-6: Hemolinfa artificial de Drosophila, com 5 mM de L-glutamato adicionado e 2 mM de Cálcio.	Reagente	N/A	NA	O L-glutamato 5 mM bloqueou as contrações musculares. Utilizamos L-glutamato de grau molecular (Sigma). O Cálcio 2 mM está próximo dos níveis fisiológicos de Cálcio na hemolinfa larval natural. Referências: Macleod et al 2002 e Macleod 2004
Dextrana, Alex Fluor 680; peso molecular 10.000, aniônica, fixável	Reagente	Molecular Probes, Life Technologies	D34680	Utilize uma câmara de perfusão de pequeno volume para manter baixo o volume total do corante
Conjugado Anti-HRP-CY5 (cabra)	Reagente	Jackson ImmunoResearch	123-175-021	Diluir 2,0 mg em 1 ml de ddH2O; fracionar em alíquotas de 4 microlitros. Congelar a –20°C. Diluir uma alíquota em 100 microlitros de HL-6
Kit de marcação com anticorpo Alexa 647	Reagente	Molecular Probes, Life Technologies	A10475	Preparamos um total de 80 microlitros de anticorpo primário conjugado e armazenamos em alíquotas de 2 microlitros. Diluímos cada alíquota em 100 microlitros de HL-6 para marcação.
Óleo de imersão formulado sob encomenda, índice de refração 1,3379	Reagente	Cargill Labs	Formulado sob encomenda
Pinça ultrafina	Ferramenta	Fine Science Tools	11252-23 ou 11295-20
Tesoura de mola	Ferramenta	Fine Science Tools	91500-09
Tesoura de corte ultrafina	Ferramenta	Fine Science Tools	15200-00
Câmara de perfusão série RC 20	Ferramenta	Warner Instruments	64-02222
Confocal de disco giratório	Microscópio	Quorum Technologies	Quorum Wave FX	Montado em um microscópio invertido Leica DMI6000