Aplicação de eletrofisiologia às sinapses acessível fornece uma medida quantificável de atividade sináptica, útil na análise de mutantes sináptica. Este artigo descreve um método de dissecação usada para expor as junções neuromusculares (MNJ) de Caenorhabditis elegans (C. elegans) E discute brevemente alguns dos usos que esta preparação pode ser aplicada.
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Artigo de método
Dissecação e gravação a partir da junção neuromuscular C. Elegans
Neste artigo
Resumo
Resumo
Neurotransmissão é o processo pelo qual os neurônios de transferência de informação através de sinais químicos para sua pós-sinápticos metas, numa escala de tempo rápido. Esse processo complexo exige a atividade coordenada de muitas proteínas pré e pós-sinápticos para garantir a conectividade sináptica apropriada, a condução de sinais elétricos, segmentação e priming de vesículas secretoras, detecção de cálcio, fusão de vesícula, localização e função de receptores pós-sinápticos e, finalmente, a reciclagem mecanismos. Neurocientistas como é o nosso objetivo de elucidar quais as proteínas em função de cada uma dessas etapas e compreender seus mecanismos de ação. Gravações eletrofisiológicas das sinapses fornecer uma quantificáveis ler fora dos eventos subjacentes elétricos que ocorrem durante a transmissão sináptica. Ao combinar esta técnica com a poderosa gama de ferramentas moleculares e genéticos disponíveis para manipular proteínas sinápticas em C. elegans, podemos analisar as mudanças resultantes funcional na transmissão sináptica.
O C. elegans NMJs formadas entre neurônios motores e parede do corpo locomoção controlar os músculos, por isso, os mutantes com fenótipos descoordenada locomotora (conhecido como unc s), muitas vezes a transmissão sináptica perturbar a estes um sinapses. Desde unc mutantes são mantidos em uma fonte rica de uma fonte de alimento de bactérias, eles permanecem viáveis, desde que manter alguma capacidade de bombeamento da faringe para ingerir alimentos. Isto, juntamente com o fato de que C. elegans existir como hermafroditas, lhes permite passar progênie mutante sem a necessidade de comportamentos de acasalamento elaborado. Estes atributos, juntamente com nossa capacidade de gravar recentes do worms NMJs 2,3,7 tornar este organismo modelo excelente para abordar precisamente como unc neurotransmissão impacto mutantes.
O método envolve a dissecção vermes adultos imobilizando usando uma cola cyanoacrylic, a fim de fazer uma incisão na cutícula verme expondo a NMJs. Desde C. adultos elegans são apenas 1 mm de comprimento a dissecção é realizada com o uso de um microscópio de dissecação e requer coordenação olho-mão excelente. MNJ gravações são feitas por toda célula de tensão de aperto individuais corpo células da parede muscular e liberação do neurotransmissor pode ser evocado através de uma variedade de protocolos de estimulação, incluindo a estimulação elétrica, activado pela luz despolarização canais rodopsina mediada 4 e hiperosmótico salino, os quais serão brevemente descritos.
Protocolo
A. Preparação das ferramentas utilizadas para a dissecção.
- A câmara de dissecção / gravação: Nós normalmente construímos nossa câmara de gravação de um 1 / 16 ª folha polegadas magnético, com um furo circular perfurado no centro que é grande o suficiente para acomodar a 22 mm de diâmetro tampa de vidro circular. As dimensões externas da câmara vai depender do estágio do microscópio usado para fazer as gravações. No verso da folha magnética, damos um 48 x 60 lamínula mm, qual aderimos à câmara pela colocação de um pellet de baixa cera derreter tecido Paraplax incorporação em cada canto da tampa de deslizamento imprensado entre o vidro ea câmara .....
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Discussão
O modelo genético organismo C, elegans é ideal para o estudo da transmissão sináptica, através da análise funcional de mutações em genes que codificam proteínas sinápticas. Aqui nós descrevemos uma técnica de dissecção que torna o C. elegans NMJs acessíveis para análise eletrofisiológica. O vídeo que acompanha retrata as etapas críticas na C. elegans dissecção e da configuração da gravação típico usado para medir a atividade sináptica. As três etapas que representam os maiores desafios em apre.......
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Agradecimentos
Este artigo foi financiado por concessões do NIH para JER. Gostaria de agradecer ao Dr. Alex Gottschalk para fornecer os vermes transgênicos expressando canal de rodopsina em neurônios colinérgicos do motor usado em uma das manifestações de gravação.
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Referências
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