Após a formação do tubo neural, o neuroepitélio contrai e dobras, enquanto o tubo se enche de líquido cefalorraquidiano embrionárias (eCSF) para formar os ventrículos do cérebro embrionário. Nós desenvolvemos esta técnica de injeção do ventrículo para visualizar melhor o espaço cheio de líquido, em contraste com a forma neuroepiteliais em um embrião vivo.
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Artigo de método
Zebrafish Injection Ventrículo Cerebral
Neste artigo
Resumo
Resumo
Formação adequada do ventrículo do cérebro durante o desenvolvimento embrionário do cérebro é necessário para a função cerebral normal. Ventrículos cerebrais são as cavidades altamente conservadas dentro do cérebro que são preenchidos com fluido cerebrospinal. Em peixes-zebra, após a formação do tubo neural, o neuroepitélio sofre uma série de constrições e dobras, enquanto ele se enche de fluido, resultando na formação de ventrículo cerebral. A fim de compreender o processo de formação do ventrículo, e as mudanças que ocorrem neuroepiteliais forma, ao mesmo tempo, precisávamos de uma forma de visualizar o espaço do ventrículo em comparação com o tecido cerebral. No entanto, a natureza de embriões zebrafish transparente torna difícil diferenciar o tecido do espaço ventrículo. Por isso, desenvolvemos uma técnica de injeção ventrículo cerebral onde o espaço de ventrículo é preenchido com um corante fluorescente e fotografada pela claro e microscopia de fluorescência. O claro e as imagens fluorescentes são então processadas e sobrepostos no Photoshop. Esta técnica permite a visualização do espaço do ventrículo com o corante fluorescente, em comparação com a forma do neuroepitélio na imagem de campo claro. Injeção cérebro ventrículo no peixe-zebra pode ser empregado a partir de 18 horas após a fecundação até o início fases larval. Temos utilizado esta técnica extensivamente em nossos estudos de formação do cérebro do ventrículo e morfogênese, bem como na caracterização de mutantes cérebro morfogênese (1-3).
Protocolo
Protocolo
Parte 1: Preparando-se para microinjeção
- Prepare-se para a injeção puxando agulhas capilar utilizando Sutter extrator de agulhas Instruments.
- Preencha a agulha com um corante fluorescente (como Texas Red-Dextran).
- Montar a agulha em um aparelho de microinjeção e micromanipulador.
- Cortar a agulha para o tamanho apropriado em um ângulo para criar uma ponta chanfrada.
- Medir o tamanho de gota e verifique se ele está entre 1-2nl por injecção de óleo.
Parte 2: Preparando os embriões
- Injetar os embriões 30 minutos mais cedo do que o estágio de ....
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Discussão
Neste vídeo demonstramos como injetar corante fluorescente (Texas-Red Dextran) no desenvolvimento de ventrículos cerebrais zebrafish. Este método é usado para visualizar o espaço do ventrículo cerebral em contraste com a neuroepitélio circundante e é extremamente útil para determinar a forma do espaço ventrículo, bem como a forma do tecido cerebral circundante. Ela nos permite compreender melhor o processo de formação do cérebro e morfogênese do ventrículo cerebral ao longo do tempo no embrião vivo. Esta técnica é uma e.......
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Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer a Laura Anne Lowery, que desenvolveu essa técnica no laboratório. HS é suportada por NIHMH70926. Jennifer Gutzman foi apoiado pelo companheirismo CSBI / Merck pós-doutorado.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários | |
|---|---|---|---|---|
| Pinzas | Ferramenta | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Tubos capilares (agulhas) | Ferramentas | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | |
| Placas revestidas com agarose | Ferramentas | Agarose (Seakem GTG; Lonza) Placas (Corning) | Agarose (50027) Placas (430166) | Prepare a camada de agarose com aproximadamente 2-3 mm de profundidade na placa, dependendo do estágio do embrião que você está injetando. |
| Microsscópio estereoscópico | Microsscópio | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Câmera de microscópio com capacidade de fluorescência e software de captura de imagens | Ferramentas | |||
| Pontas de pipeta de 1-200 μL | Ferramentas | USA Scientific, Inc. | 1111-0806 | Essas pontas têm o tamanho ideal para furar a agarose e permitir que os embriões se encaixem perfeitamente. |
| Photoshop | Análise de imagem | Adobe | ||
| Laço para embrião | Ferramentas | Confeccione esses laços com uma pipeta de vidro e um fio de cabelo ou linha de pesca, selando com cera de abelha. | ||
| Microinjetor | Ferramentas | Harvard Apparatus | PL1-100 | |
| Puxador de agulhas | Ferramentas | Sutter Instrument Co. | Configurações (Calor 785, Tração 70, Velocidade 40, Tempo 70). | |
| Micromanipulador | Ferramentas | Narishige International | ||
| Corante fluorescente Texas-Red Dextran 70.000 MW | Reagente | Molecular Probes, Life Technologies | D1830 | Outros pesos moleculares estão disponíveis, se desejado. |
| Tricaina (éster etílico do ácido 3-aminobenzóico) | Reagente | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| Meio para embriões | Reagente | De acordo com Westerfield (5) |
Referências
- Gutzman, J. H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech. Dev. 125, 974-983 (2008).
- Lowery, L. A. Characterization and Classification of Zebrafi....
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Reimpressões e permissões
