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Protocolo
Parte 1: Preparando-se para microinjeção
- Prepare-se para a injeção puxando agulhas capilar utilizando Sutter extrator de agulhas Instruments.
- Preencha a agulha com um corante fluorescente (como Texas Red-Dextran).
- Montar a agulha em um aparelho de microinjeção e micromanipulador.
- Cortar a agulha para o tamanho apropriado em um ângulo para criar uma ponta chanfrada.
- Medir o tamanho de gota e verifique se ele está entre 1-2nl por injecção de óleo.
Parte 2: Preparando os embriões
- Injetar os embriões 30 minutos mais cedo do que o estágio de interesse. Por exemplo, para estudar os ventrículos menos 24 horas após a fertilização (hpf), injetar os embriões em 23,5 hpf. Estágio os embriões de acordo com Kimmel et al. (4).
- Sob o estereomicroscópio, remova cuidadosamente o córion dos embriões usando uma pinça.
- Usando um prato de plástico revestidas com agarose 1%, poke buracos na agarose com uma ponteira de plástico 100-200 mL. Remova cuidadosamente os plugues de agarose dos furos usando uma pinça.
- Transferência de embriões em meios embrião no prato agarose com buracos.
- Adicionar tricaina (feita de acordo com Westerfield (5)) para a mídia para anestesiar os embriões e evitar qualquer movimento durante o experimento.
- Delicadamente, coloque a cauda do embrião para dentro do buraco, e orientá-la de modo que o aparelho de injecção está no lado posterior do embrião.
Parte 3: A injeção do ventrículo cerebral
- Para injetar o ventrículo cerebral, providenciar a instalação de micromanipulação de modo que a ponta da agulha está no mesmo campo de visão como o embrião em potência alta.
- Cuidadosamente coloque a agulha através da roofplate fina do rombencéfalo apenas posterior à hingepoint r0/r1 sem bater o tecido cerebral abaixo.
- Apenas o suficiente injetar corante para encher completamente os ventrículos. Pode levar várias injeções para preencher o espaço ventrículo, dependendo do estágio do embrião.
Parte 4: Imaging
- Usando um limpa 1% agarose prato revestido, poke novos buracos no prato, retire as velas, e adicione tricaina para anestesiar os embriões e impedir o movimento.
- Coloque a cauda do embrião ventrículo-injetado no buraco e posição para uma imagem dorsal.
- Tirar uma foto usando luz transmitida.
- É muito crítico para não mover o embrião ou microscópio.
- Alterar as configurações no microscópio e ter uma imagem com luz fluorescente.
- Reposicionar o embrião para tirar fotos com os dois laterais luz transmitida e luz fluorescente.
- Guardar as imagens como arquivos TIFF para processamento de imagens em Photoshop.
Parte 5: Processamento de Imagem
- Para processar as imagens no Photoshop, abra a luz transmitida e luz fluorescente imagens do embrião mesmo tomadas na mesma posição. Certifique-se de todas as configurações são as mesmas para cada imagem.
- Arraste a imagem fluorescentes para a imagem de luz transmitida e alinhá-las com exatidão.
- Com a imagem selecionada fluorescentes, selecione "Imagem", "Ajustes," e depois "Substituir cor" e mudar o fundo preto ao branco.
- No "Substituir cor" janela ajustar a "imprecisão" fator para a direita até as imagens fluorescentes parece uniforme em cor.
- No "Layers" janela, selecione "Multiply" para ver as imagens de sobreposição. Sua imagem de espaço ventrículo deve corresponder à imagem de luz transmitida com exatidão.
- Salve este arquivo e repita para quaisquer outras imagens.
Resultados representante / Resultado
Adequada imagens injeção ventrículo são mostrados na Figura 1 AD painéis, enquanto um exemplo de imagens de injeção incorreta são mostrados na EH. Injeções adequada têm arestas vivas e não-difusa corante. Injeção incorreta, que ocorre quando a agulha é inserida longe demais para o ventrículo e atinge o tecido cerebral abaixo, pode resultar em corante que é visível fora do espaço ventrículo e na gema.
Figura 1. Ventrículo injeções de 25 hpf embriões de tipo selvagem. (AD) método de injeção correta e (EH) método de injeção incorreta são mostrados como exemplos. (A, E) imagens brightfield dorsal com correspondentes imagens fluorescentes (B, F) ea sobreposição das imagens fluorescentes e brightfield (C, G) para métodos de injeção corretas e incorretas mostrado. Setas indicam regiões onde corante foi além do espaço do ventrículo cerebral devido a uma injeção ventrículo incorreta (consulte "Solução de problemas"). Anterior é para a esquerda em todas as imagens.
Solução de problemas:
| Problema | Remédio |
| Você está esmagando o embrião com a agulha. | Sua agulha é demasiado brusco ou a ponta é muito grande. | Comece com uma agulha nova e não quebrá-lo, tanto para trás. Bisel da agulha para torná-lo seu afiada como uma agulha de seringa. |
| O corante é em todo o embrião e da gema (ver Fig. 1E-H). | Sua agulha atravessou o tecido e não ficar no espaço ventrículo. | A agulha não pode ser afiado o suficiente, então você é incapaz de controlar a velocidade de punção. |
| O corante é muito fraco ou não na parte frontal do cérebro. | Você não usar uma pressão alta o suficiente para a injeção, ou a agulha não foi longe o suficiente para alcançar o anterior do prosencéfalo quando injetado o corante. | Aumentar a sua pressão de injeção ou colocar a agulha um pouco mais durante a injeção anterior. Você pode colocar a agulha através da fronteira mesencéfalo rombencéfalo-se mais detalhe é necessário no prosencéfalo. Você também pode simplesmente esperar um pouco para o corante para difundir ainda mais antes de imagem. |
| Suas imagens fluorescentes são escuras em torno das bordas após a substituição de cores no Photoshop. | Você se esqueceu de mudar a "confusão" na janela de configuração substitui a cor. | Mover a "confusão" por todo o caminho à direita na janela de substituição de cor. |
| A agulha não perfurar a roofplate rombencéfalo. | A agulha não é cortado corretamente. | Faça uma nova agulha. Se você estiver fazendo um monte de injeções que você pode precisar de várias agulhas como eles podem obter maçante. |
Causa