Lente de desenvolvimento envolve interações com outros tecidos. Mutantes olho várias zebrafish são caracterizados por um tamanho de lente anormalmente pequena. Aqui demonstramos um experimento de transplante de lente para determinar se este fenótipo é devido a causas intrínsecas ou interações com defeito com os tecidos que circundam a lente.
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Artigo de método
Transplante de lente em Zebrafish e sua Aplicação na Análise de Mutantes Eye
Neste artigo
Resumo
Resumo
A lente tem um papel importante no desenvolvimento do cálice óptico [1,2]. Usando o zebrafish como um organismo modelo, questões relativas ao desenvolvimento da lente pode ser tratada. O peixe-zebra é útil para estudos genéticos, devido a várias características vantajosas, incluindo pequeno tamanho, alta fecundidade, ciclo de vida curto, e facilidade de cuidado. Desenvolvimento lente ocorre rapidamente em zebrafish. Em 72 hpf, a lente zebrafish é funcionalmente maduros [3]. Abundantes recursos genéticos e moleculares estão disponíveis para apoiar a investigação no zebrafish. Além disso, a semelhança do olho zebrafish aos de outros vertebrados fornece base para a sua utilização como excelente modelo animal de defeitos humanos [4-7]. Mutantes zebrafish várias lentes apresentam anormalidades, incluindo altos níveis de morte celular, que em alguns casos, leva a uma degeneração completa de tecidos lente [8].
Para determinar se as anormalidades lente são devido a causas intrínsecas ou com defeito interações com os tecidos circundantes, o transplante de uma lente de mutantes em um olho do tipo selvagem é executada. Agulhas utilizando-fogo de metal polido, lentes mutante ou tipo selvagem são cuidadosamente dissecados do animal doador, e transferido para o host. Para distinguir os tecidos do tipo selvagem e mutante, uma linha de transgênico é usado como o doador. Esta linha expressa ligada à membrana GFP em todos os tecidos, incluindo a lente. Esta técnica de transplante é uma ferramenta essencial nos estudos de mutantes lente zebrafish.
Protocolo
Parte 1: Preparando os embriões
Neste protocolo, vamos usar o jj símbolo xy para denotar um mutante lente hipotética zebrafish.
- Cepas de peixe-zebra são mantidos em condições de instalação padrão peixes em 28,5 C em um ciclo light/10h 14h escuro.
- À noite, os machos e fêmeas lugar da cepa zebrafish jj xy: AB / TU; tg (mGFP) em um tanque com um divisor de separá-los uns dos outros. A progênie desta cruz vai expressar o transgene GFP em todos os tecidos, e serão utilizados como doadores. Em paralelo, use o mesmo procedimento para configurar o cruzamento entre não-transgênicas do ti....
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Discussão
Várias etapas requerem atenção especial durante transplantes lente.
- Afiadas agulhas: É melhor preparar várias agulhas antes de realizar o transplante de lente, e na ponta das agulhas deve ser o mais fino possível. A agulha mais grossa vai rasgar mais tecido devido ao seu maior diâmetro, causando uma falha no olho para curar.
- Organizando os embriões: Direita antes do transplante você deve posicionar os embriões para que eles estão mentindo em seus lados. Ao posicionar, a agarose 1,2% pode endurecer.......
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Agradecimentos
Este procedimento segue em grande medida a técnica de transplante desenvolvido para peixes caverna pelo laboratório de Bill Jeffrey.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Fio de tungstênio com diâmetro de 0,1 mm | A Johnson Matthey | 45086 | |
| Agarose (ponto de fusão baixo) | Sigma-Aldrich | 39346 | |
| Capilares de vidro borossilicato | World Precision Instruments, Inc. | TW 100-4 | |
| Pinça | Dumont | 11252-30 | |
| Pipeta de Pasteur | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Bomba para pipeta | Fisher Scientific | 13-683C | |
| Placa de Petri | Cardinal Health | D1906 | |
| Penicilina-estreptomicina | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 |
Referências
- Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens. Dev Biol. 231, 63-76 (2001).
- Yamamoto, Y., Jeffery, W. R.
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Reimpressões e permissões
