Preparação Cell Block da amostra citologia com predomínio de células individualmente Scattered

Introdução:

Este é um vídeo que descreve o método Shidham para a preparação de células bloco de líquidos à base de amostra citologia (LBC), utilizando HistoGelTM (Thermo Scientific) (HG). Em comparação com outras abordagens aleatórias, são as duas características essenciais deste protocolo para a preparação de blocos de células a partir de amostras relativamente hipocelular com células isoladas espalhadas soltas (1-5).

1. Este protocolo envolve as etapas de concentrar as células ao longo do plano paralelo à superfície de corte do bloco de células.
2. Também inclui uma inclusão beacon-like escuro da AV-marcador (Figura 1b), que serve duas das seguintes finalidades:
   1. Para visualizar o nível em que as células estão concentradas. A área do bloco de células com as células de interesse agora pode ser visualizado pelo histotechnologist quando o farol de cor escura é exposto durante o corte. Esta capacidade de monitorar o impediriam de corte através do nível com a maioria das células, ou não cortar demasiado superficial para o nível com maior concentração de células da amostra.
   2. Para servir como um ponto de referência de localização na seção de série célula bloco em slides diferentes. Este ponto de referência atua como um farol para ajudar a localizar células ou grupos específicos de células para avaliação de um padrão de imunorreatividade coordenar com a abordagem SCIP (6,7).

PROTOCOLO (Figura 2)

Preparação da amostra.

1. Transferir a amostra residual LBC citologia cervical para um tubo com fundo de vidro planas (15mm de diâmetro x 45mm) (Figura 2.1 a 2.4). Coloque o tubo de vidro em uma grande tubo plástico transportadora (28 x 85 milímetros) e centrifugar. Retire o tubo com fundo de vidro do tubo transportador e despeje o sobrenadante.
2. O tubo de vidro é então tampado (para evitar derramamento de aquecimento de água na próxima etapa) e colocado de volta dentro de um flat tubo maior fundo de plástico transportadora
3. O tubo de plástico contendo transportadora o tubo de vidro é então tampado, colocados em uma centrífuga (com xícaras giratórias e não copos ângulo fixo para que as células incidem perpendicularmente ao fundo plano do tubo de vidro), e girou em 1805 G (3000 rpms, raio-17cm rotor) por cinco minutos (Figura 2.5).
4. Os tubos são então removidas verticalmente a partir da centrifugação e do tubo de vidro menor é retirado com uma pinça a partir do maior tubo de plástico sem perturbar o sedimento sedimentada com as células.
5. O tubo de vidro com a amostra é destampado eo sobrenadante é decantado tomando cuidado para não perturbar a camada plana de células de sedimentos no fundo (Figura 2.6).

Inclusão das coordenadas de referência AV marcador e adição de gel

1. Um farol escuro AV-marcador (cerca de 2 mm X 2 mm de tamanho, superfície plana, fragmento de material escuro, colorido sectionable) (Figura 3) é adicionado como um sinal para o tubo de vidro (Figura 2.7).
2. Liquefazer uma alíquota de HG pelo derretimento em microondas por 10 segundos na potência média.
3. Adicionar 0,5 ml de HG fundido ao tubo de mistura, com o sedimento rapidamente, e recap-lo (Figura 2.8) (Vá para o próximo passo rapidamente, sem permitir que o HG para começar a solidificar).
4. Adicionar cerca de 2,5 ml de água morna (45 ° C) de água para o tubo de plástico transportadora (Figura 2.9).
5. O tubo de vidro tampado menor é colocado dentro do tubo de plástico com água morna. (Este passo é necessário para manter o HG de solidificar durante os próximos passos) (Figura 2.9).
6. O tubo de plástico transportadora é colocada na centrífuga (com xícaras giratórias e não copos ângulo fixo para que as células incidem perpendicularmente ao fundo plano do tubo de vidro), e girou em 1805 G (3000 rpms, raio-17cm rotor) por cinco minutos. O objetivo desta etapa de centrifugação é para empurrar o marcador AV-e concentrar as células em uma camada mais próxima da superfície de corte do último bloco de celas incluído em parafina (Figura 1d).
7. Os tubos são então removidas com cuidado e verticalmente a partir da centrífuga tomando cuidado para não perturbar a camada sedimentada fina com células da amostra na parte inferior.
8. O tubo plástico é maior sem tampa eo tubo de vidro menor é removido verticalmente por uma pinça, sem perturbar a camada de sedimento de células da amostra.
9. O tubo de vidro pequeno é refrigerado na posição vertical por 15 minutos para esfriar e solidificar o HG (Figura 2.11).

Remoção dos blocos de células como um botão de gel com a amostra para o processamento final

1. O disco HG solidificado, com a camada de concentrado / sedimento amostra no fundo é desalojado do tubo plana com fundo de vidro por esguichando formalina a 10% através de uma agulha de calibre 23 com a seringa (Figura 2.12).
2. A agulha é inserida ao longo da lateral do tubo na periferia do disco solidificou HG com a amostra (Figura 2.12).
3. O needle é rodado ao longo do lado do tubo, enquanto formol está lentamente empurrado através da seringa. Isso resulta na separação do botão HG junto com farol de cor escura AV-marcador e da amostra concentrada nele desde o fundo plano do tubo de vidro (Figura 2.12).
4. O bloco de células (botão gel com células amostra) é então colocada em um cassete rotulado e submetido a processamento de tecidos para preparar blocos parafinados de células (Figura 2.13).

Incorporação e corte do espécime

1. O disco está embebido em parafina com o lado escuro farol marcador para baixo como superfície de corte (Figura 1).
2. O bloco é seccionada até a cor escura marcador de AV como um farol é exposto e claramente visíveis.
3. Três a quatro seções micron são cortados a partir deste nível que deve conter a maioria das células isoladas espalhadas a partir do espécime.
4. As seções são coletados na lâmina de vidro para coloração mais, coloração imuno-histoquímica, ou outros testes, como indicado. Os protocolos para estes testes, incluindo o tipo de slides para utilizar para a montagem das seções pode variar. Geralmente para imunomarcação, slides revestidos são usados ​​para prevenir flutuante e perda de seções do slides durante as etapas de imunocoloração.

Abreviaturas utilizadas (em ordem alfabética): CISH, cromogênico testes de hibridização in-situ; FISH, Fluorescente testes de hibridização in-situ; FFPE, parafina fixadas em formalina; FNA, aspirativa por agulha fina; HG, HistoGel ™ (Thermo Scientific); LBC, citologia líquida baseada; PCR reação em cadeia da polimerase;

Figura 1. A estrutura do bloco de celas preparado pelo protocolo de Shidham.

Figura 2. O resumo das diferentes etapas para a preparação de blocos de células de uma amostra LBC por protocolo de Shidham.

Figura 3. Preparação de AV-marcador de cascas de banana.

Figura 4. Comparação de blocos de células e seções com e sem AV-marcador.

Figura 5. Comparação de celularidade das seções do bloco de células com e sem AV marcador.

Cell blocks are a valuable tool for evaluation of various cytology specimens (1). Most importantly, in addition to the architectural details of the specimen, cell blocks allow for evaluation of ancillary studies such as immunocytochemistry, fluorescent/chromogenic in-situ hybridization tests (FISH/CISH) and in-situ PCR. A variety of methods for preparation of cell block are described. However, most of these are suitable for non-gynecologic cytology specimens which contain relatively many cells and with tissue microfragments such as in FNA aspirates and some serous fluids such as effusions (1,3,4,5).

Because cell blocks primarily provide the opportunity for immunocytochemical evaluation, their processing should preferably be similar to that of the formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues. Ultimately the results obtained after immunocytochemical evaluation of cell block sections are compared to those with the published literature performed predominantly on FFPE tissue sections. Any alterations in the protocol potentially compromise and nullify the validity of the results obtained on cell blocks processed through different fixatives and reagent sequences other than that used for routine FFPE. Some commercial techniques may have the drawback of processing through a protocol of exposure to other fixative-reagent exposure.

Various methods of cell block preparation are available for specimens with a significant quantity of sediment and tissue fragments. Principally, the concentrated sediments are supported by some gel or coagulation principle. The maneuverable button is then embedded in paraffin after processing like the surgical pathology specimens/biopsies.

The gels used include gelatin, agar, fibrinogen/plasma-thrombin, and other commercial gels such as HG. The methods of concentration vary from simple pelleting of the sediment by centrifugation to concentration of cells along various types of membranes. Examples include: Milipore, collodin (Celloidin) bags or scraping the cells from the cytology smears on glass slides (1). We also evaluated a variety of gels by trying different combinations of agar and gelatin. None of the combinations achieved the a firm enough consistency to obtain an easily maneuverable disc of solidified gel with embedded cells from the specimen in one piece. HG showed appropriate consistency and in our experience the immunostaining results on HG cell block sections have been excellent.

Liquid based cytology (LBC) specimens for cervicovaginal cytology are generally less cellular than non-gynecologic specimens as mentioned above. In addition, the gynecologic LBC specimens predominantly contain individual scattered exfoliated superficial cells from cervicovaginal mucosa. Due to this, appropriate cellularity within the cell block sections may not be achieved without a special approach. As these singly scattered cellular components in the the block cannot be seen by the histotechnologist during section cutting, the level at which the cells start appearing in the sections cannot be appreciated and may be missed, either by cutting past the level with most cells or not cutting deep enough into the level with highest concentration of sample cells (Figure 4). Shidham’s protocol addresses both of these issues using HG as embedding medium and conventional lab equipments (2) (Figure 2).

This protocol involves following two major features (Figure 1):

1. Concentration and alignment of singly scattered cells in a narrow plane adjacent and parallel to the cutting surface of the cell block (Figure 5).
2. Inclusion of a beacon-like dark AV-marker as a signpost. This is critical for achieving following features:
   1. Identifying and monitoring the level at which the cells are concentrated in the cell block. The exposure of the dark colored signpost highlights the level at which most of the singly scattered cells in the cell block are expected to be located (Figure 4). This prevents the overcutting (cutting past the level with most cells) or undercutting (not cutting deep enough into the level with highest concentration of sample cells) in to the cell block and allow selection of the sections from the level in the cell block corresponding with highest concentration of cells.
   2. The dark colored signpost in the sections also serves as a reference point to survey and identify exactly the same cells in different serial sections of the cell block on different slides (Figure 4). This is critical while interpreting and evaluating the coordinate properties such immunoprofile of particular cells by the SCIP approach to follow the same cells in different sections (6,7).

Although our protocol is standardized and reported for liquid based cervical cytology specimens, it can also be used to enhance diagnostic yield of many other non-gynecologic specimens such as effusion fluids, FNA, brushings, cyst contents etc. In addition the AV marker would facilitate improved application of SCIP approach during immunohistochemical evaluation of cell block sections of these specimens. The embedding medium may be replaced by other reagents with appropriate modifications at relevant steps. HG may be replaced by plasma (Fibrinogen) to be gelled by Thrombin at room temperature (1).