Geração de humanos CD40-activated células B

Resumo

Neste vídeo, apresentamos a Ex vivo Geração e expansão de células CD40-activated B (CD40-B) a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de estimulação com CD40 ligante e interleucina-4.

Resumo

Células CD40-activated B (CD40-células B) foram identificados como uma fonte alternativa de imuno-estimulatórias células apresentadoras de antígenos (APC) para imunoterapia de câncer ^1-3. Em comparação com as células dendríticas (DCs), a melhor caracterizada APC, as células CD40-B têm várias propriedades biológicas distintas e técnicos. Semelhante ao DCs, as células B mostram um aumento da expressão de MHC e moléculas co-estimulatórias (Fig.1b), apresentam uma forte capacidade migratória e apresentação de antígenos presentes de forma eficiente para células T, após a estimulação com a interleucina-4 e CD40 ligante (CD40L). No entanto, em contraste com DCs imaturas ou maduro, as células CD40-B expressar a tríade completa nó de linfa homing consistindo de CD62L, CCR7/CXCR4 e função antígeno leucocitário-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessário para homing para órgãos linfóides secundários (Fig.1a) ^3. Células CD40-B pode ser gerado sem dificuldades a partir de quantidades muito pequenas de sangue periférico que pode ser expandida in vitro de quantidades muito grandes de alta-pura-B CD40 células de câncer (> 10 ⁹ células por paciente) de doadores saudáveis, bem como pacientes (Figura 1C, d) ^1,4.

Neste protocolo que demonstrar como obter totalmente ativado CD40-B a partir de células PBMC humana. Moléculas-chave para a cultura de células são CD40 ligante, a interleucina-4 (IL-4) e ciclosporina A. (CsA), que são reabastecidos em um ciclo de 3-4 dias de cultura Para fins de laboratório CD40-estimulação é fornecida por células que expressam NIH/3T3 recombinante ligante CD40 humano (tCD40L NIH/3T3) ^5. Para evitar a contaminação com os não-transfectadas células, a expressão do ligante CD40 humano no transfectants tem de ser verificados regularmente (Fig.2).

Após 14 dias CD40-B culturas de células consistem de mais de 95% de células B puro e uma expansão de células CD40-B com mais de 65 dias é frequentemente possível, sem qualquer perda de função de ^{1, 4.} Células CD40-B de forma eficiente recolher, processar e apresentar antígenos às células T ^6. Eles não só naϊve prime, mas também expandir células T de memória ^7,8. Células CD40-B ativado pode ser usado para estudo de células B ativação, diferenciação e função. Além disso, eles representam uma ferramenta promissora para a vacinação preventivo ou terapêutico contra tumores ^9.

Protocolo

O protocolo para a geração de células CD40-activated B da CMSP é dividido em duas partes: Parte A demonstra a preparação de CD40 ligante expressar NIH/3T3 células, que serão usados ​​como células da placa-bound alimentador. Parte B descreve a cultura CD40-B real.

A. Preparação de células alimentadoras (tCD40L NIH/3T3)

O NIH/3T3 tCD40L é uma linha de células aderentes murino de fibroblastos, que nunca deve tornar-se completamente confluentes. As células são, portanto, dividido por duas vezes por semana. Cultura há mais de seis semanas não é recomendado.

1. Remova o meio de idade a partir da cultura prim....

Materiais

A. Preparação de Media:

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Alimentador celular médio do tipo selvagem	Alimentador meio de seleção de célula
Reagente	Concentração	Reagente	Concentração
DMEM-Ham / F12		DMEM-Ham / F12
L-Glutamina	365 mcg / mL	L-Glutamina	365 mcg / mL
FBS	10%	FBS	10%
HEPES	10 mM	HEPES	10 mM
Gentamicina	15 mcg / mL	Gentamicina	15 mcg / mL
		G-418	0,7 mg / mL

CD40-B médio de lavar	CD40-B meio de cultura
Reagente	Concentração	Reagente	Concentração
IMDM		IMDM
L-Glutamina	584 mcg / mL	L-Glutamina	584 mcg / mL
HEPES	25 mM	HEPES	25 mM
Gentamicina	15 mcg / mL	Gentamicina	15 mcg / mL
		rh Transferrina	50 mg / mL
		Insulina rh	5 mg / mL
		AB-Humanserum	10%

B. Diversos Reagentes:

Reagente	Companhia	Despacho n.
F12 DMEM / Ham	PAA	Nenhum gato: E15-813
IMDM	Invitrogen Gibco ®	REF 21980-032
PBS Dulbecco (10x)	PAA	Cat Não H15-011
AB-soro humano	Invitrogen	Cat Não 34005100
holo-transferrina humana	Sigma	Cat Não T0665
Insulina humana	Sigma	Cat Não I2643
Gencin ®	Selecione Delta	Arte Sem 7395800
Interleucina-4 humana recombinante	Immunotools	Cat Não 11130045
Ciclosporina A	Novartis	Cat Não NDC 0078-0109-01
FBS	LONZA	Cat Não DE14-802C
Tampão HEPES	PAA	Cat Não S11-001
G-418 Sulfato	PAA	Cat Não P02-012
Tripsina / EDTA (10x)	Invitrogen Gibco ®	REF 15400-054

Fontes C. Diversos:

Reagente	Companhia	Despacho n.
Pipeta estéril dicas	Sarstedt
6-bem placa	NUNC	Não Cat 140675
50mL tubo cônico	BD Falcon ™	Não Cat 352070
Frasco de cultura de tecidos	SARSTEDT	Cat Não 83.1813.002