Artigo de método

Fazendo Zebrafish Diplóide Gynogenetic por pressão inicial

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DOI:

10.3791/1396

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30 de junho de 2009

 ,  , 
1Institute of Neuroscience, University of Oregon, 2Division of Basic Science, Fred Hutchinson Cancer Research Center - FHCRC

Neste artigo

Resumo

Este é um método para a geração de embriões diplóides gynogenetic zebrafish (embriões cuja única contribuição genética vem da mãe), bloqueando a segunda divisão meiótica imediatamente após a fertilização com esperma de luz ultravioleta inativado. EP embriões não são totalmente homozigótica devido à recombinação durante a primeira divisão meiótica, porém eles são homozigotos em todos os loci que não foram separadas de suas centrômero por recombinação.

Resumo

Heterozigosidade em eucariotos diplóides muitas vezes faz estudos genéticos pesado. Métodos que produzir descendentes viáveis ​​diplóide homozigoto diretamente de mulheres heterozigotas permitir que as fêmeas F1 mutagenizados para ser exibido diretamente para mutações deletérias em uma tela acelerado para frente genética. Streisinger et al.

Protocolo

Visão geral da pressão inicial

Nota: receitas para muitos dos reagentes utilizados neste protocolo, como tricaina, peixes de água salina e Hanks estão disponíveis online no capítulo 10 do Livro Zebrafish 3 ( http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html )

  1. Produzir embriões por fertilização in vitro com esperma inativado UV.
  2. Transferir imediatamente os ovos fertilizados em um frasco de vidro (com uma tampa de encaixe de plástico) cheia até a borda com água de ovo. Cobrir a extremidade aberta do frasco com uma folha fina de látex de borracha e encaixe a parte superior (em que um buraco foi cortado) para o frasco sobre a borracha.
  3. Coloque o frasco em uma prensa hidráulica e em 1,4 min após a fertilização elevar a pressão a 8.000 psi (Note que pressiona muitos são calibrados para ler a pressão exercida sobre um pistão de diâmetro de 2 polegadas, e as leituras devem ser convertidos em psi)
  4. Início em 6 min após a fertilização, gradualmente, liberar a pressão durante um período de 1 min.

Procedimento de pressão detalhada início

  1. Dia antes experimento
    1. No final da tarde, os machos e fêmeas em separado para ser espremido. Qualquer homem velho pode ser usado desde que ele não vai estar contribuindo material genético. As fêmeas devem olhar grandes e gordura na barriga. Homens devem olhar amarelo e ágil.
    2. Segure fêmeas e machos separadamente durante a noite nos reservatórios de retenção, onde podem ser facilmente acessados ​​pela manhã.
  2. Manhã de experiência
    1. Prepare a solução de Hanks, adicione bicarbonato de sódio.
    2. Trazer para instalação de peixe: balde de gelo, Hanks, tricaina, timer, tubos para coleta de esperma.
    3. Diluir em água tricaina peixes
  3. Coletar o esperma
    1. Prepare um frasco de solução de clara de Hanks no gelo. Medida ~ 50 ul por macho para ser espremido.
    2. Anestesiar 3 ou 4 homens ao mesmo tempo por imersão em tricaina. Elas podem ser retiradas do anestésico com uma colher de plástico.
    3. Enxágüe em água de peixes e blot "úmido-seco" em uma toalha de papel (muito importante: o esperma ativa água).
    4. Montagem de peixes em um suporte de espuma sob um estereomicroscópio com ampliação baixa com epi-iluminação. Separar os nadadeiras pélvicas com uma pinça e uma posição microcapilar na abertura da cloaca.
    5. Curso os lados dos peixes suavemente, mas firmemente com suave (Millipore) fórceps.
    6. Como o esperma leitoso sair do poro genital, coletá-lo no microcapilar usando uma sucção suave.
    7. Piscina do esperma de vários machos em solução salina gelada de Hank. Esperma dos machos 50-10 é adequado para a fertilização de várias centenas de ovos. Esperma no frio Hanks vai continuar a fertilizar ovos de forma eficiente por várias horas ou mesmo dias. "Eyeball" a concentração de espermatozóides, recolhendo o suficiente para fazer uma suspensão turva.
  4. UV inativar os espermatozóides
    1. Encha o fundo de uma placa de Petri de vidro com gelo.
    2. Coloque um vidro de relógio em cima do gelo no prato.
    3. Com uma pipeta Pasteur, transferir o esperma do tubo de ensaio para o vidro de relógio. Ter certeza de obter o máximo de esperma na pipeta possível sem ocupar as bolhas de ar com ele. Além disso, não bolha do esperma no vidro de relógio como você é expulsá-los da pipeta. Expelir esperma em uma camada fina e uniforme em vidro de relógio. Descarte este pipeta.
    4. Coloque a placa de Petri em um UV cross-linker
    5. Ligue reticulador por 2 minutos
    6. Usando uma pipeta limpa, remova o esperma do vidro de relógio e transferir para um tubo eppendorf marcada Sperm UV e colocar no gelo.
  5. Coleta de ovos e fertilização in vitro
    1. Anestesiar três ou quatro mulheres em um momento em tricaina.
    2. Enxágüe em água de peixes e blot "úmido-seco" em uma toalha de papel. O excesso de água vai inchar os ovos e evitar a fecundação.
    3. Coloque a fêmea em um prato de plástico 35 milímetros de Petri e com umidade (não molhado) dedos, pressione suavemente mas com firmeza na barriga. Se ela está preparada para botar ovos, eles vão sair com bastante facilidade.
    4. Recolher os ovos com uma espátula e retorne a fêmea para a água. Ovos são uma cor boa, amarelado translúcido, que os ovos que permaneceram na mulher por muito tempo são brancos e aguado (veja abaixo). Para garantir a obtenção de ovos bons, coletá-los durante as primeiras 2 horas após as luzes se acendem na instalação de peixe. Mantenha os ovos cobertos para evitar ressecamento.
    5. Adicionar 3-50 mL da suspensão de espermatozóides UV para os ovos, mexa delicadamente com a ponta da pipeta.
    6. Imediatoly adicionar cerca de 1 ml de água de peixe e iniciar o temporizador. Ovos deixados para desenvolver neste momento será haplóides.
  6. . Pressure início Nota: as etapas ag deve ser realizado dentro de 90 segundos da fecundação!
    1. Iniciar o temporizador no momento que os ovos são ativados pela adição de água
    2. Aguarde alguns instantes e adicione mais água, os ovos redemoinho para o centro do prato.
    3. Utilizando um cut-off e polido Pasteur pipeta, transferir os ovos fertilizados para os frascos de pressão.
    4. Se necessário, adicione mais água ovo para os frascos de modo que eles estão quase transbordando, deixando uma gota de água no lábio dos frascos.
    5. Coloque uma rolha de borracha sobre o filete de água e segura a tampa de plástico sobre a borracha.
    6. Coloque o frasco (s) de cabeça para baixo no cilindro de pressão, adicionando uma água mais ovos para encher o cilindro. Coloque a parte superior do cilindro de forma segura.
    7. Coloque o cilindro na imprensa com o êmbolo para cima e aplicar £ 8.000 / m². pol
    8. Deixe o cilindro na imprensa até 6 min após o tempo de ativação (por um tempo total de 4,5 min de pressão).
    9. Aos 6 min após a ativação, retire o cilindro da imprensa, e retire os frascos do cilindro. Cuidadosamente os frascos secos para evitar resfriamento dos embriões.
    10. Redefinir o cilindro e recarregá-lo com água do ovo.
    11. Prepare os frascos próxima preenchendo parcialmente com água de ovo, conforme necessário.
    12. Repita o procedimento para todos os lotes de ovos.

NOTA: O cilindro irá realizar até 3 frascos de cada vez, então você pode querer atrasar a fecundação dos ovos de alguns minutos para ver se outras fêmeas já no tricaina dar ovos. Isso vai ajudar a acelerar as coisas, tratando lotes mais de uma vez. Além disso, lembro de uma vez a imprensa está sendo usado não colocar mais peixes no tricaina até que o tratamento seja concluído. Permitindo que os peixes para ficar no anestésico muito tempo pode matá-los. Em segundo lugar, se você apertar peixe, enquanto a imprensa está sendo usado, e obter os ovos, elas podem ser muito seco para ser viável no momento em que a imprensa pode ser usado novamente.

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Discussão

É importante certificar-se que os embriões produzidos por este método são diplóides gynogenetic verdade. Como controles, gerar uma ninhada de ovos diplóides normal (mantendo de lado algum do esperma sem UV inativação) e uma embreagem de embriões haplóides (mantendo de lado uma ninhada de ovos fertilizados com esperma UV sem passar pelo procedimento EP). Menos 1 dia após a fertilização de embriões haplóides têm um eixo de corpo curto, cérebro e morfologia irregular somito. Haplóides não são viáveis ​​após 2-3 dias. Dipló...

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Agradecimentos

Métodos de fertilização in vitro e diplóides gynogenetic foram desenvolvidos para zebrafish por Charline Walker no laboratório de George Streisinger na Universidade de Oregon nos anos 1970 e 1980. O método descrito aqui não é alterado a partir de protocolos Charline, que estão disponíveis na íntegra em O Livro Zebrafish 3.

Métodos de fertilização in vitro e diplóides gynogenetic foram desenvolvidos para zebrafish por Charline Walker no laboratório de George Streisinger na Universidade de Oregon nos anos 1970 e 1980. O método descrito aqui não é alterado a partir de protocolos Charline, que estão disponíveis na íntegra em O Livro Zebrafish 3.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
TricainaSigma-Aldrich
Vidro de relógio
Prensa de French
Cilindro de pressão
Instant ocean
Pipetas de PasteurRetirar a extremidade estreita, polir com chama
Cross-linker de UV
Microcapilares

Referências

  1. Streisinger, G. Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish. Genetics. 112 (2), 311-311 (1986).
  2. Streisinger, G. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-293 (1981).
  3. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).
  4. Johnson, S. L., Africa, D., Horne, S., Postlethwait, J. H. Half-tetrad analysis in zebrafish: mapping the ros mutation and the centromere of linkage group I. Genetics. 139 (4), 1727-1727 (1995).
  5. Beattie, C. E., Raible, D. W., Henion, P. D., Eisen, J. S. Early pressure screens. Methods Cell Biol. 237 (71), 2575-25 (1999).
  6. Johnson, S. L. Centromere-linkage analysis and consolidation of the zebrafish genetic map. Genetics. 142 (4), 1277-1277 (1996).
  7. Trede, N. S. Zebrafish mutants with disrupted early T-cell and thymus development identified in early pressure screen. Dev Dyn. 237 (9), 2575-2575 (1999).

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