Phosphoproteomics quantitativa em ácidos graxos estimulada Saccharomyces cerevisiae</em

Resumo

Descrição de um processo de fosforilação quantitativa usando cryolysis, solubilziation uréia, fracionamento e enriquecimento HILIC IMAC de peptídeos fosforilados.

Resumo

Este protocolo descreve o crescimento e estímulo, com o oleato de ácidos graxos, de células de Saccharomyces isotopicamente leves e pesados ​​S.. Células são solo usando um procedimento cryolysis em um moedor de moinho de bolas e os grindate resultando colocada em solução de solubilização da uréia. Este procedimento permite a lise das células em um estado metabolicamente inativas, preservando fosforilação e evitando reorientação da phosphoproteome durante a lise celular. Após a redução, alquilação, digestão com tripsina das proteínas, as amostras são dessalinizada em colunas C18 e da complexidade amostra reduzida por fracionamento através de cromatografia de interação hidrofílica (HILIC). Colunas HILIC preferencialmente reter moléculas hidrofílicas que é bem adequado para phosphoproteomics. Peptídeos fosforilados tendem a eluir mais tarde no perfil cromatográfico do que as contrapartes não fosforilado. Após o fracionamento, fosfopeptídeos são enriquecidos por cromatografia em fase de metal imobilizado, que conta com carga baseada em afinidades de enriquecimento fosfopeptídeos. No final deste procedimento as amostras estão prontas para serem analisadas quantitativamente por espectrometria de massa.

Protocolo

Crescimento celular e media

1. Uma única colônia de células BY4742Δarg4Δlys1 overnight em 100 mL de rich media para um OD ₆₀₀ de 1,0 sementes, em seguida, em duas culturas 1 litro de um meio de levedura mínimo (0,17% Base de Dados de nitrogênio fermento sem sulfato de amônio ou Aminoácidos, sulfato de amônio 0,5%), contendo uma conjunto completo de aminoácidos, suplementado com L / 20mg de arginina isotopicamente normal ou pesado ⁽¹³ C ₆ ¹⁵ N _4; Isotec) e lisina ⁽¹³ C ₆ ¹⁵ N _2; Isotec).
2. As células foram cultivadas por 18 horas, para um OD

Discussão

Este método irá produzir um enriquecimento da fosfopeptídeos que podem ser analisadas quantitativamente. Um número de parâmetros podem ser alterados neste protocolo, mas o aspecto mais importante a lembrar é o de preservar a sua fosforilação. Preparação de células para a quantificação pode ser alcançado em um número de diferentes maneiras, por exemplo, se você não pode rotular suas células in vivo, tags, tais como ICAT [3] ou ITRAC [4] pode ser usado extração post para diferencialmente etiqueta de duas culturas.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Isotec™ L-Arginina-13C6,15N4	Sigma-Aldrich	608033
Isotec™ L-Lisina-15N2	Sigma-Aldrich	609021
GIBCO™ Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS) 7,4 (10X) líquida	Invitrogen	70011044
Comprimidos SigmaFAST de Inibidor de Protease	Sigma-Aldrich	S8820
Cocktail de Inibidor de Fosfatase Pierce Halt	Thermo Fisher Scientific, Inc.	78420
Moinho de Bolas Retsch PM100	Retsch	20.540.0001
Pote de Moagem de Aço Inoxidável Retsch 125 ml	Retsch	01.462.0148
Coluna Ultramicrospin C18	The Nest Group	SUM SS10
Sep-Pak Vac 500 mg C18	Waters	WAT043395
Coluna analítica TSK-Gel Amide-80 4,6 mm x 25 cm	Tosoh Corp.	13071	Esta é a coluna cromatográfica HILIC.
Coluna de proteção 4,6 mm de diâmetro interno x 1 cm	Tosoh Corp.	19021	Recomendamos esta coluna de proteção para prolongar a vida útil da sua coluna HILIC.
Gel de Afinidade por Ferro PHOS-Select™	Sigma-Aldrich	P9740	Esta é a resina IMAC. Aliquotar e armazenar.