Artigo de método

Preparação Spread cromossômica de células estaminais embrionárias humanas para Cariotipagem

DOI:

10.3791/1512

4 de setembro de 2009

Neste artigo

Resumo

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Cariótipo é uma técnica simples e útil amplamente utilizado para detectar alterações genéticas. Descrevemos aqui um passo a passo protocolo para a preparação cromossomo disseminação de células estaminais embrionárias humanas para monitorar o estado cromossômica dessas células mantidas em cultura.

Resumo

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Apesar de células estaminais embrionárias humanas (CTEh) foram mostrados para apresentar um cariótipo diplóide estável 1, muitos estudos têm relatado que dependendo das condições de cultura torna-se propenso a adquirir anomalias cromossômicas, como adição de conjunto ou de partes de cromossomos. Com efeito, durante longo prazo de cultura, alterações cariotípicas são observadas quando enzimática ou química de dissociação são usados ​​2,3,4, enquanto dissecção manual de colônias para passaging mantém um cariótipo estável 5. Além disso, as mudanças no ambiente, tais como a remoção de células de alimentação também parecem comprometer a integridade genética das CTEh 3,6. Uma vez que alterações cromossômicas podem afetar a fisiologia celular, a caracterização da integridade genética das CTEh in vitro é CTEh considerando crucial como uma ferramenta essencial em estudos de embriogênese e testes de drogas. Além disso, para o futuro fins terapêuticos alterações cromossômicas são uma preocupação real como ele é freqüentemente associada à carcinogênese.

Aqui nós mostramos um método simples e útil para obter spreads cromossomo de alta qualidade para posterior análise do cromossomo definido pelo G-banding, FISH SKY, ou técnicas de CGH 7,8. Recomendamos que verifique o estado cromossômicas rotineiramente com intervalos de 5 passagens a fim de monitorar o aparecimento de translocações e aneuploidias

Priscila Britto e Rafaela Sartore contribuíram igualmente para o papel.

Protocolo

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EQUIPAMENTO

  • Cultura de tecidos incubadora, 37 ° C CO, 5% 2
  • Centrifugador
  • Conjunto de micropipettors (100, 100μL)
  • Banho-maria 37 ° C
  • Banho-maria 90 ° C a ser fonte de vapor de água
  • Microscópio de contraste de fase

PRIMEIRO PASSO

Tratar as células com Colcemid

Neste procedimento foi utilizada a linha CTEh H9 cultivadas sobre fibroblastos embrionárias de rato (MEF) inativados com mitomicina C (Sigma) e mantidos em DMEM/F12 (Invitrogen) suplementado com a substituição knockout 20% de soro (KSR, Gibco) e 8ng/mL de f....

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Discussão

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A preparação dos spreads cromossomo é um passo crítico para uma análise bem sucedida do estado genético das células-tronco embrionárias pelo rotineiramente técnicas como bandamento G, e as técnicas mais sofisticadas, como FISH, SKY e CGH.

Este procedimento pode ser aplicado para vários tipos de células, variando o período de incubação Colcemid, que depende da duração do ciclo celular. Para colônias de células-tronco embrionárias, vamos esperar três horas enquanto que para corpos embrióides (.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada a declarar.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo cônico de 15 mlTechno Plastic Products91015
Colcemid Karyo MAXGIBCO, by Life Technologies15212-012
EDTAIsofar721
Ácido acético glacialIsofar100
MetanolIsofar208
Cloreto de potássio (KCl)Merck & Co., Inc.104.931.000
LâminaBioslide7105-1
TripsinaSigma-AldrichT4799

Referências

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  1. Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1145 (1998).
  2. Draper, J. S. Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 22 (1), 53-53 (2004).
  3. M....

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