Descrevemos os procedimentos detalhados para a transfecção eficiente de DNA plasmidial nas fibras dos músculos do pé de ratos ao vivo usando o eletroporação ea visualização posterior de expressão da proteína através de microscopia de fluorescência.
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Artigo de método
Transfecção de DNA de mamíferos usando músculos esqueléticos In Vivo Eletroporação
Neste artigo
Resumo
Resumo
A crescente interesse em biologia celular é a de expressar formas transgenicamente modificado de proteínas essenciais (por exemplo, constrói fluorescente etiquetado e / ou variantes mutantes), a fim de investigar sua distribuição endógenos e relevância funcional. Uma abordagem interessante que foi implementada para cumprir este objectivo em células totalmente diferenciadas é o
Protocolo
Procedimentos experimentais para a eletroporação in vivo de músculos FDB e IO
- Antes de iniciar o em protocolos de eletroporação in vivo, plasmídeos de expressão de mamífero deve ser amplificado para produzir concentração na faixa de 2-5 mg para Nota plasmídeo / mL de TE:. Rotineiramente usar kits de amplificação comerciais e seguir os procedimentos do fabricante. Comercial plasmídeos expressão carregando o trabalho promotor CMV muito bem no músculo esquelético em transfections vivo.
- Volume da alíquota necessária (10-20 mL) da solução de plasmídeo e salve-o em dois tubos Eppendorf de 0....
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Discussão
Descrevemos aqui os passos detalhados que devem ser seguidas a fim de atingir transfections eficaz de plasmídeos de DNA em fibras musculares esqueléticas em por eletroporação in vivo. As principais vantagens da nossa abordagem são a simplicidade de implementação, e sua mínima invasividade que resulta em perigo para a saúde negligenciável para os animais. Na realidade, os protocolos acima descritos eletroporação não implicam muito mais do que duas injeções subcutâneas por pé, seguido por um protocolo de.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a declarar.
Agradecimentos
Agradecemos ao Dr. T. Otis, Departamento de Neurobiologia, UCLA, para compartilhar as instalações TPLSM conosco, Dr. C. Fahlke, Instituto de Fisiologia, RWTH Aachen, Alemanha, para o tipo de doação o plasmídeo pEYFP-ClC1, eo Sr. . R. Serrano para suporte técnico. Este trabalho foi suportado por concessões do NIH / NIAMS concede AR047664 e AR54816.
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Referências
- Muangmoonchai, R., Wong, S., Smirlis, D., Phillips, I., Shephard, E. Transfection of liver in vivo by biolistic particle delivery. Molecular Biotechnology. 20 (2), 145-151 (2002).
- DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. Voltage-....
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Reimpressões e permissões
