Dissecção de 6,5 embriões de camundongos dpc

Resumo

Isolamento de pós-implantação de embriões em estágio permite uma padronização para estudar e analisar genes de células de linhagem processos de decisão durante o desenvolvimento embrionário, mas dissecção adequada do embrião em estágio inicial pode ser um desafio. Este protocolo descreve um método para isolar muito primitiva raia-estágio-embriões (~ 6,5 dias pós coitum [dpc]).

Resumo

Análise dos padrões de expressão genética durante as fases iniciais do desenvolvimento embrionário de mamíferos pode fornecer pistas importantes sobre a interação gene função, célula-célula e mecanismos de sinalização que patterning guia embrionárias. No entanto, a dissecção do embrião de rato a partir da decídua, pouco após o implante pode ser um processo desafiador, e documentação passo-a-passo detalhado desse processo é inexistente.

Aqui demonstramos como pós-implantação (6,5 dpc) embriões são isolados pela primeira dissecando o útero de um rato grávidas (detecção do plug vaginal foi designado coitum poist dias 0,5) e, posteriormente, dissecando o embrião da decídua materna. A dissecção da membrana Reichert é descrito, bem como a remoção do cone ectoplacental.

Protocolo

Dissecação de órgãos reprodutivos de uma fêmea

1. As fêmeas grávidas são sacrificados por asfixia CO _2, utilizando gás comprimido.
2. Coloque o animal em decúbito dorsal almofada absorvente e mergulhe-o em etanol 70% para reduzir o risco de contaminação a dissecção com cabelo mouse.
3. Aperte a pele e fazer uma pequena incisão lateral na linha média com tesouras cirúrgicas regulares. Segure a pele firmemente acima e abaixo da incisão e puxar a pele para além em direção à cabeça e cauda para expor o abdômen.
4. Segure o peritônio com uma pinça e corte para expor a cavidade abdominal.
5. Localize os órgãos reprodutivos na região dorsal da cavidade do corpo: dois cornos uterinos, o oviduto e os ovários.

Primitive Streak estágio Dissection (6,5 dpc)

1. Remover o corno uterino, segurando o útero abaixo do oviduto e cortá-la livre ao longo da mesométrio. Lugar útero dissecado em PBS gelado.
   
   
   
   Figura 1
   
   
2. Separe cada embrião cortando entre locais de implantação ao longo corno uterino.
   
   
   
   Figura 2
   
   
   
3. Segure o revestimento muscular uterina, deslizando forceps relojoeiro entre a camada muscular circunvizinho e do tecido envolvido decídua. Retire a camada muscular, expondo a decídua.
   
   
   
   Figura 3
   
   
4. Clipe de fora de uma parcela da decídua expostas no ápice (aproximadamente 1 / 5 do tecido decídua), que irá expor a ponta midventral ou distal do embrião fechado.
   
   
   
   Figura 4
   
   
5. O embrião pode ser descascado, utilizando as pontas de uma pinça. Pierce a decídua com uma pinça em torno do embrião e uma pinça aberta a lágrima decidua distante.
   
   
   
   Figura 5
   
   
6. Uma vez que embrião é removido, a membrana Reichart ainda pode ser anexado, bem como o cone ectoplacental (trofoblasto). O embrião pode ser dissecada ainda por dissecção cuidadosa.
   
   
   Figura 6
   

Discussão

Pós-implantação em ratos ocorre entre 4,5 dpc e nascimento. Este método de dissecação pode ser aplicada, essencialmente como descrito, para isolar mais cedo ou mais tarde embriões em estágio 5,5-8,5 dpc.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pinça microcirúrgica serrilhada, reta	Ferramenta	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5130	2 pares
Pinças microcirúrgicas padrão #55 INOX	Ferramenta	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5010	2 pares
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco’s (1x)	Reagente	Invitrogen	14190
Placa de Petri estéril de poliestireno Fisherbrand	Ferramenta	Fisher Scientific	08-757-12
Paraformaldeído a 4% em PBS	Reagente
Tesoura cirúrgica reta com ponta afiada	Ferramenta	Fisher Scientific	08-940
Camundongas fêmeas grávidas	Animal
Microscópio cirúrgico	Microscópio