A Novel Reporter RFP para ajudar na visualização do Disco Imaginal Eye em Drosophila</em

Resumo

Nós descrevemos um romance vermelho proteína fluorescente repórter (RFP) que se expressa especificamente na Drosophila. Detalhamos uma metodologia para a dissecção do disco imaginal olho e como este repórter pode ser utilizada para auxiliar na dissecção e identificação de tipos específicos de células no olho desenvolvimento.

Protocolo

1. O primeiro lugar uma gota de PBS em um prato Sylgard sob um microscópio de dissecação.
2. Em seguida remover larvas várias vagando terceiro de um frasco ou garrafa com uma espátula e colocá-los na PBS.
3. Para começar a dissecção usar suas pinças mão esquerda (se você for destro) para agarrar uma larva de dois terços do caminho para a posterior e depois usar o outro par para manter a boca escura ganchos coloridos no final da anterior.
4. Agora puxe a larva movendo para além dos dois pares de pinças longe um do outro. O aparelho bucal deve vir longe do resto do corpo com o complexo de olho / cérebro em anexo.
5. Para os discos mancha olho para corrigir os discos de imunofluorescência, neste ponto, colocando-os em paraformaldeído a 4% / solução de PBS por 30-45 minutos em gelo. Em seguida, lave os discos quatro vezes com PBST e mancha em seguida, com anticorpos adequados.
6. É mais fácil para dissecar os discos olho diretamente em um slide. Coloque uma gota de PBS em um slide e mover os discos para a gota de PBS, segurando o aparelho bucal.
7. Os tecidos imaginal são translúcidas e assim à primeira vista os discos são difíceis de identificar. Para tornar mais fácil identificá-los usar um microscópio de dissecação com capacidade de fluorescência. Usando o olho-line repórter RFP os discos do olho pode ser claramente visto como o tecido fluorescente vermelha Sobrepondo os lóbulos esféricos óptico (Figura 1).
8. Se você estiver usando uma fonte de luz de fibra óptica frio direcionar a luz em um ângulo oblíquo para o slide, pois isso dará os discos maior contraste. Os discos olhos / antena estão ligados aos lobos óptica via o talo na óptica posterior e para o aparelho bucal através de uma haste que vem a partir do disco antenais na anterior.
9. Para dissecar os discos olho segurar o aparelho bucal usando um par de pinças e usar o outro par de separar os discos olho do cérebro larval. Separar os próximos discos dos olhos do aparelho bucal. Finalmente remover o aparelho bucal do slide como estes podem evitar a lamela de deitado.
10. Quando você tem todos os discos dissecados olhos delicadamente inclinar a lâmina e secar o excesso de PBS. Em seguida, adicione uma gota de Vectashield e coloque delicadamente uma lamela por cima.
11. Os discos são agora pronto a ser trabalhada por qualquer microscopia de epifluorescência ou confocal (Figura 2).

Resultados Representante

Quando dissecados corretamente o disco olhos / antena devem estar nivelados no slide clara de qualquer tecido externos, tais como o cérebro. Os pólos dorsal e ventral do disco olho são curvas e por isso tendem a desistir, mas isso pode ser evitado tomando um Z-série em um microscópio confocal e omitindo estas seções da projeção. Embora o disco é um epitélio monocamada as posições variáveis ​​dos núcleos requerem uma projeção Z-série para obter uma imagem geral do disco. A projeção de um olho-olho RFP típicas / disco antenais tomada em um microscópio confocal é mostrado na Figura 2. Normalmente, tomar 1 seções M através do disco usando uma lente de 20x ou 40x. O repórter-olho RFP é localizada nuclear e assim o padrão observado na Figura 2 representa o núcleo das células que expressam RFP.

Figura 1. Dissecção inicial do olho / cérebro de um complexo de terceiro instar de olhos RFP larva Drosophila. O olho / disco imaginal antenais (esboçado) pode ser visto ligado ao aparelho bucal (MP) e da sobreposição do lobo óptico (OL) do cérebro. A imagem foi tirada utilizando um microscópio de fluorescência de dissecação para mostrar a expressão RFP no disco olho. Anterior é para a esquerda. Barra de escala: 300 mm.

Figura 2. Expressão do repórter-olho RFP no disco imaginal olho. Um olho de terceiro instar (ED) / disco antenais (AD) dissecada a partir de uma larva de olhos RFP mostrando RFP expressão (vermelho). O disco foi corado com phalloidin (verde), que as manchas superfície celular apical e mostra o sulco morfogenéticos (seta). RFP é expressa em células precursoras em torno do MF, em fotorreceptores 1,6,7 e em células cone. Anterior é para a esquerda. Barra de escala: 25 mm.

Discussão

Dissecção do disco imaginal Drosophila olho é simples, mas pode levar algum tempo para dominar. Os passos críticos são a identificação do disco olho e sua dissecção longe do cérebro larval. Identificação do disco olho é mais fácil usar a linha dos olhos-RFP descrito aqui. Modificações possíveis são para remover o disco antenais ou a membrana peripodial, ou deixar o lobo óptico ligado a visualizar os axônios PR entrar no cérebro.

A linha dos olhos-RFP foi gerada por clonagem uma nove...