Gravações de uma única célula de sucção de cones fotorreceptores rato

Resumo

Vamos mostrar como gravar respostas flash de cones do mouse usando um eletrodo de sucção.

Resumo

Haste e cone fotorreceptores na retina são responsáveis ​​pela detecção de luz. Na escuridão, nucleotídeo cíclico-gated (CNG) no segmento de canais externos são abertos e permitem o fluxo constante cátions para o interior através da membrana, despolarizando a célula. Exposição à luz provoca o fechamento dos canais de CNG, bloqueia o fluxo para dentro cação atual, e, portanto, resulta em hiperpolarização celular. Com base na polaridade de fotorreceptores, um método de gravação de sucção foi desenvolvido em 1970 que, ao contrário da técnica patch-clamp clássico, não requer penetrar a membrana plasmática

Protocolo

Fazendo eletrodos

1. Fazer a gravação usando eletrodos de um puxador de micropipeta e polonês os eletrodos com filamento de aquecimento sob o microscópio. Para mouse gravação de sucção cone de uma única célula, o diâmetro interno da ponta do eletrodo é de cerca de M 6-7.
2. Prepare eletrodos de referência. Pesar agar 1% em água destilada. Derreta a solução ágar-ágar em banho de água quente. Preencha as pipetas de vidro (L = 100 mm, OD / ID = 1/0.75 mm) com 1% agar usando seringa. Solidificar o ágar em temperatura ambiente por 10 minutos.
3. Cortar as pipetas em metades usando uma faca de diamante.
4. Mergulhe os eletrodos de referência na solução de referência para pelo menos 24 horas a 4 ° C.

Configurando o experimento

5. Escuro adaptar um rato em uma gaiola preta durante a noite.
6. Preparar 100 mL de solução de referência e uma solução de perfusão L (veja abaixo) e filtrar a solução.
7. Dissolver 0,1% BSA e 10 mM de glicose em 20 mL de solução de referência.
8. Calibrar a intensidade de luz do estimulador óptico utilizando fotômetro.
9. Monte a câmara de gravação no palco do microscópio invertido.
10. Solução da bolha da perfusão com 95% O ₂ / 5% CO _2, incubar em banho-maria 40 ° C para aumentar a solubilidade de CO _2. A solução flui da garrafa para a câmara de gravação passando por um resistor de cerâmica aquecendo-a 36-38 ° C. O aquecedor deve estar localizado o mais próximo da câmara de gravação possível, de preferência na fase do microscópio.
11. Ajuste o regulador de fluxo de um fluxo de cerca de 1-1,5 mL / min.
12. Preencher o eletrodo de registro com a solução de referência. Insira o eletrodo em um porta-eletrodo. Certifique-se que não há bolhas no eletrodo. Montar o suporte no headstage do amplificador. Conecte o seu titular a um dispositivo de sucção, que é construído ligando tubo parcialmente cheio com óleo mineral ao lado da porta do porta-eletrodo. A outra extremidade do tubo é conectado a um pequeno reservatório de óleo mineral, para que a pressão pode ser aplicada por via oral.
13. Conecte o eletrodo de referência para o outro pólo da headstage. Vincular o casal térmica (TC) para o eletrodo de referência. Certifique-se que as pontas de eletrodos e TC estão juntos para que a leitura da temperatura é tida como próxima da célula como possível.
14. Ligue a iluminação por infravermelhos para visualizar o eletrodo. O eletrodo é visto pela câmera de infravermelho conectado a um monitor. Centro da imagem o eletrodo no campo visual e do monitor usando um micro-manipulador.
15. Ajustar a posição do próximo da ponta do eletrodo de referência (2-4 mm) para a ponta do eletrodo de gravação.
16. Ajustar a tensão DC para o aquecedor de modo que a temperatura da solução é de cerca de 36-38 ° C.
17. Executar um teste de vedação para verificar a resistência do eletrodo de registro, normalmente cerca de 900 kW.

Isolar a retina do rato

18. Sob luz vermelha ofuscante, euthanize o mouse de adaptação ao escuro com CO ₂ e deslocamento cervical. Marcar o globo ocular com a ponta de uma tocha de metal líquido, cauterização o ponto mais dorsal da esclera ligeiramente. Enuclear do globo ocular usando uma tesoura. Todos os procedimentos subseqüentes são realizadas sob a luz infravermelha.
19. Hemisect os globos oculares em microscópio com iluminação infravermelha e conversores de imagem.
20. Remova a córnea ea lente. Remover o máximo do vítreo possível.
21. Para gravar M cone-respostas, remova a parte ventral da ocular ⁴ com uma lâmina de barbear a julgar pela marca cautério.
22. Descasque a retina da camada de epitélio pigmentar.
23. Achatar a retina e colocá-lo na parte inferior da placa de Petri cheia de 1-2 mL solução de referência.
24. Fatia da retina em pequenos pedaços finos usando uma lâmina de barbear e incube a preparação em uma caixa à prova de luz saturada com oxigênio puro.

Gravações

25. Desligue o aquecedor temporariamente. Mudar o fluxo de perfusão a uma tubulação de desvio para evitar que a câmara de secagem.
26. Escorra a maioria da solução na câmara usando um pedaço de tecido Kimwipe. Transferir a suspensão retina para a câmara de gravação usando uma pipeta de vidro.
27. Aguarde cerca de 2 minutos até as fatias de retina sossegar. Mudar a perfusão de volta. Ligar o aquecedor.
28. Ligue iluminação por infravermelhos para visualizar a preparação. Busca de um pedaço de retina deitado na câmara com segmentos fotorreceptoras exterior saindo (ver figura exemplo). Desenhar segmentos interior suavemente o eléctrodo por sucção. Nesta configuração, vários núcleos e segmentos internos devem ser atraídos para o eletrodo. Registre a photoresponse a um flash brilhante para testar se um segmento de cone interior é no eletrodo e se a célula é curartua, a julgar pela cinética de resposta e amplitude.
29. Inferior do reservatório mineral de aplicar uma ligeira pressão negativa para a ponta do eletrodo para ajudar a segurar o segmento interno no eletrodo.
30. Registro de teste flash-respostas de dim com a intensidade luminosa, uma vez por celular bom é encontrado. Flashes de teste são fornecidos a partir de um estimulador calibrado óptica ^5. Flash intensidade e comprimento de onda são controladas por um conjunto de filtros de densidade neutra e filtros de interferência de banda estreita, respectivamente. Teste de flash duração (20 ms) é controlado por computador-driven persianas.

Soluções

1. Solução de perfusão do mouse: 112,5 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl _2, 1,2 mM CaCl _2, 10 mM HEPES (pH 7,4), 20 mM NaHCO _{3, 3} mM Na succinato, 0,5 mM Na glutamato, 0,02 mM EDTA, e 10 mM de glicose.
2. Rato solução eletrodo de registro: 140 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl _2, 1,2 mM CaCl _2, 3 mM HEPES (pH 7,4), 0,02 mM EDTA.

Discussão

De uma única célula de gravação de sucção de células fotorreceptoras foi desenvolvido três décadas atrás. Ele nos permite gravar trans-membrana mudança corrente induzida pela estimulação luminosa sem penetrar a membrana celular. Por causa da adesão celular de alta, é difícil isolar vara única saudável e cone da retina do rato como retina de anfíbios e é difícil encontrar cones individuais devido ao baixo percentual (3%) e tamanho pequeno. O segmento interno--in (IS-in) método de gravação supera esta dificuldade actual d...