Artigo de método

Visualizando Localização RNA em Xenopus Oócitos

DOI:

10.3791/1704

⸱

14 de janeiro de 2010

 , 
1Department of Molecular Biology, Cell Biology, and Biochemistry, Brown University

Neste artigo

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Resumo

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Visualização de In vivo RNA de transporte é realizado por microinjeção de transcrições fluorescente etiquetado RNA em Xenopus Oócitos, seguido por microscopia confocal.

Resumo

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Localização de RNA é um mecanismo conservado do estabelecimento de polaridade celular. Vg1 mRNA localiza-se o pólo vegetal de oócitos Xenopus laevis e age para restringir espacialmente expressão gênica de Vg1 proteína. Um controlo apertado da Vg1 distribuição desta forma é necessário para especificação apropriada germe camada no embrião em desenvolvimento. Elementos de seqüência RNA na 3 'UTR do mRNA, o elemento de localização Vg1 (VLE) são necessários e suficientes para transporte directo. Para estudar o reconhecimento e transporte de Vg1 mRNA in vivo, temos desenvolvido uma técnica de imagem que permite a análise extensiva de trans-fator de mecanismos de transporte através de uma leitura dirigida visual simples.

Para visualizar a localização RNA, podemos sintetizar RNA fluorescente etiquetado VLE e microinject esta transcrição em oócitos individual. Após o cultivo de oócitos para permitir o transporte do RNA injetado, ovócitos são fixos e desidratado antes de imagens por microscopia confocal. Visualização dos padrões de localização mRNA fornece uma leitura para o monitoramento da via completa de RNA de transporte e para a identificação de papéis na direção de RNA de transporte para cis-acting elementos dentro da transcrição e trans-acting fatores que se ligam ao VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). Nós estendemos esta técnica através de co-localização com RNAs adicionais e proteínas (Gagnon e Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), e em combinação com a perturbação de proteínas motoras eo citoesqueleto (Messitt et al., 2008) para investigar mecanismos subjacentes localização mRNA.

Protocolo

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Parte 1: Transcrição de mRNA fluorescente etiquetado.

  1. Linearizar DNA plasmídeo contendo o elemento de localização RNA ou seqüência relevante e ressuspender em 1 mcg / mL com DEPC tratadas com H 2 O. O modelo de DNA deve ter sites de promotor a montante para a transcrição de T7, SP6, ou RNA polimerase T3.
  2. Adicionar os seguintes reagentes a um tubo de 1,5 ml estéril:
    a. 10X Tx buffer (ver M & M) 2 l
    b. 20X cap / NTP mix (ver M & M) 1 ml
    c. 1 mM Alexa Fluor 546-14-UTP (Invitrogen) 1 ml
    d. UTP, [α-32 P] (1 μCi / mL) (Per....

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Discussão

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Aqui nós apresentamos um protocolo para a visualização de localização mRNA em oócitos Xenopus. Este método, usando transcrições fluorescente etiquetado RNA tem maior relação sinal-ruído do que o anteriormente obtido com marcada com digoxigenina transcrições e é mais simples e mais rápido do que in-situ abordagens baseadas (Mowry e Melton, 1992, Gautreau et al., 1997). Usando este método, podemos engenheiro RNA mutações sequência e rapidamente teste para função in vivo. Além disso, usando adici.......

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Divulgações

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Experimentos com animais de laboratório foram realizados em conformidade com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Brown University.

Agradecimentos

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Nosso trabalho na localização RNA é suportado por uma concessão do NIH (R01GM071049) a KLM.

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Materiais

Tx tampão 10X

  • 60 mM MgCl 2
  • 400 mM Tris-HCl (pH 7,5)
  • 20 mM espermidina-HCl

20x mix cap / NTP

  • 10 mM CTP
  • 10 mM ATP
  • 9 mM UTP
  • 2 mM GTP
  • 20 mM G (ppp) G Cap Analógico (New England Biolabs)

G-50 coluna

  • Hidrato de 5 g Sephadex G-50 contas (Sigma Aldrich) em 100 ml deionizada H 2 O. DEPC de tratamento por 30 min. e autoclave. Loja de ações incompletas em temperatura ambiente. Antes de usar, adicione o seguinte RNase soluções:
  • 0,5 ml 0,2 M EDTA
  • 1 ml 1 M Tris pH 8,0
  • 0,5 ml SDS 20%
  • Loja completa G-50 solução a 4 ° C.
  • Remover e descartar o êmbolo de uma seringa de 3 ml (BD Biosciences) e colocar o cano da seringa para um tubo cônico de 15 ml (Corning). Ligue a seringa com uma pequena quantidade de lã de vidro (uma ficha cerca de metade do tamanho de uma moeda de um centavo).
  • Redemoinho solução G-50 completa para voltar a suspender contas.
  • Adicionar 2 ml G-50 solução para a coluna vazia.
  • Rodada por 1 minuto a 1000 x g em centrífuga de bancada.
  • Adicionar 200 mL DEPC tratados com H 2 O deionizada para cada coluna. Spin.
  • Repita mais duas vezes para lavar um total de três lavagens.
  • Remover o corpo da seringa para um novo tubo cônico de 15 ml.

Solução de colagenase

  • 75 mg de colagenase Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich)
  • 25 ml 0,1 M KPO 3 + (pH 7,4)

MBSH tampão

  • 88 mM NaCl
  • 1 mM KCl
  • 2,4 mM NaHCO 3
  • 0,82 mM MgSO 4 7H 2 O X
  • 0,33 mM Ca (NO 3) 2 X 4H 2 O
  • 0,41 mM CaCl 2 X 6H 2 O
  • 10 mM HEPES (pH 7,6)

Meio de Cultura de oócitos

  • 50% L15 médio
  • 15 mM HEPES (pH 7,6)
  • Uma insulina mg / ml
  • 100 mg / ml de gentamicina
  • 50 nistatina U / ml
  • 50 U / ml de penicilina
  • 50 mg de estreptomicina / ml

MEMFA solução

  • 0,1 M MOPS (pH 7,4)
  • 2 mM EGTA
  • 1 mM MgSO 4
  • Formaldeído 3,7%

Computação rendimento RNA

  • Determine CPM em "input" e "incorporados" amostras usando um contador de cintilação padrão.
  • incorporação = ("incorporada") / (10 x "input")
  • Valores incorporação típicos variam entre 0,03 e 0,10 ~.
  • Rendimentos máximos teóricos para polimerases diferentes:
    T7, T3, SP6 - 2,64 mg
  • Rendimento da reação em mg = (rendimento máximo de polimerase usada) X (incorporação)
  • Diluir RNA a 50 nM = (mg RNA) / 320 / (comprimento de RNA em bases) / (5X10 -8)
  • A reação geralmente produz ~ 5-10 mL de RNA em 50 nM.

Referências

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  1. Cohen, S., Au, S., Pant, N. Microinjection of Xenopus laevis oocytes. JoVE. 24, (2009).
  2. Dumont, J. N. Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals. J. Morphol. 136, 153-179 (1972).
  3. Gag....

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Errata

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Formal Correction: Erratum: Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes
Posted by JoVE Editors on 6/10/2011. Citeable Link.

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Etiquetas

RNA FluorescenteMicroinje oMicroscopia ConfocalmRNA de Vg1RNA de VLECultura de O citosFixa o Desidrata oProte nas Motoras

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