Visualizando Localização RNA em Xenopus Oócitos

Resumo

Visualização de In vivo RNA de transporte é realizado por microinjeção de transcrições fluorescente etiquetado RNA em Xenopus Oócitos, seguido por microscopia confocal.

Resumo

Localização de RNA é um mecanismo conservado do estabelecimento de polaridade celular. Vg1 mRNA localiza-se o pólo vegetal de oócitos Xenopus laevis e age para restringir espacialmente expressão gênica de Vg1 proteína. Um controlo apertado da Vg1 distribuição desta forma é necessário para especificação apropriada germe camada no embrião em desenvolvimento. Elementos de seqüência RNA na 3 'UTR do mRNA, o elemento de localização Vg1 (VLE) são necessários e suficientes para transporte directo. Para estudar o reconhecimento e transporte de Vg1 mRNA in vivo, temos desenvolvido uma técnica de imagem que permite a análise extensiva de trans-fator de mecanismos de transporte através de uma leitura dirigida visual simples.

Para visualizar a localização RNA, podemos sintetizar RNA fluorescente etiquetado VLE e microinject esta transcrição em oócitos individual. Após o cultivo de oócitos para permitir o transporte do RNA injetado, ovócitos são fixos e desidratado antes de imagens por microscopia confocal. Visualização dos padrões de localização mRNA fornece uma leitura para o monitoramento da via completa de RNA de transporte e para a identificação de papéis na direção de RNA de transporte para cis-acting elementos dentro da transcrição e trans-acting fatores que se ligam ao VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). Nós estendemos esta técnica através de co-localização com RNAs adicionais e proteínas (Gagnon e Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), e em combinação com a perturbação de proteínas motoras eo citoesqueleto (Messitt et al., 2008) para investigar mecanismos subjacentes localização mRNA.

Protocolo

Parte 1: Transcrição de mRNA fluorescente etiquetado.

1. Linearizar DNA plasmídeo contendo o elemento de localização RNA ou seqüência relevante e ressuspender em 1 mcg / mL com DEPC tratadas com H ₂ O. O modelo de DNA deve ter sites de promotor a montante para a transcrição de T7, SP6, ou RNA polimerase T3.
2. Adicionar os seguintes reagentes a um tubo de 1,5 ml estéril:

   a. 10X Tx buffer (ver M & M)	2 l
   b. 20X cap / NTP mix (ver M & M)	1 ml
   c. 1 mM Alexa Fluor 546-14-UTP (Invitrogen)	1 ml
   d. UTP, [α-32 P] (1 μCi / mL) (Perkin Elmer)	1 ml
   e. DEPC-H 2 O	11 mL
   f. 0,2 M DTT	1 ml
   g. RNasin (Promega)	1 ml
   h. DNA modelo linear	1 ml
   i. RNA polimerase (Promega)	1 ml

3. Misture delicadamente os reagentes e centrifugar brevemente (10 seg. Numa microcentrífuga).
4. Incubar por 2-4 horas a 37 ° C, cobrindo o tubo com papel alumínio para evitar fotodegradação de fluoróforo.
5. Adicionar 1 ml 1 mg / ml RNase DNase (Promega) para degradar DNA template.
6. Incubar 15 minutos a 37 ° C.
7. Adicionar 79 mL 20 mM EDTA (pH 8,0) para parar a reação.
8. Retire 1 ml para um tubo separado, rotulados como "input" e salve.
9. Reação através de um spin-1 ml G50 coluna (ver Materiais e Métodos), que incluirá unincorporated nucleotídeos, excluindo mRNA de corpo inteiro.
10. Concentrar o RNA por precipitação de etanol:
    1. Adicionar 250 mL de etanol 100%, 10 ml 7M CH ₃ COONH _4, 1 ml transportadora RNA (tRNA levedura, 10 mcg / mL) ou 1 mL de glicogênio (20 mg / ml).
    2. Misture bem e leve ao freezer até sólida a -80 ° C durante> 30 minutos ou em gelo seco por 15 minutos.
    3. Giram em velocidade máxima em microcentrífuga por 15 minutos, decantar o sobrenadante.
    4. Lavar com 150 mL de etanol 75%.
    5. Rodada por 3 minutos na velocidade máxima em microcentrífuga sobrenadante, decantar.
    6. Secar o pellet a 37 ° C por 3 minutos, garantindo que todo o etanol tenha evaporado.
11. Ressuspender em 11 mL DEPC-H ₂ O e remover 1 ml para um tubo separado, rotulados como "incorporados".
12. Determinar a incorporação por cento e diluir o RNA a 50 nM (ver Materiais e Métodos de cálculo).
13. O RNA devem ser congeladas em 5 alíquotas mL, para uso único para evitar congelamento / descongelamento e pode ser armazenado por várias semanas a -80 ° C.

Parte 2: Preparando-se para microinjeção.

1. Preparação RNA:
   Descongelar uma alíquota de RNA (50 nM), e desnaturar a RNA a 70 ° C por 3-5 minutos. Giro por 10 minutos em microcentrífuga a temperatura ambiente na velocidade máxima para remover quaisquer partículas, e continuar a gelo.
2. Preparação de ovócitos:
   1. Remover cirurgicamente ovário de Xenopus laevis fêmeas (Nasco).
   2. Peças de acabamento de Xenopus laevis ovário em um tubo de 50 ml contendo 25 ml de solução de colagenase (ver Materiais e Métodos).
   3. Agitar suavemente a 18 ° C por 15 minutos, ou até oócitos são visivelmente separados do ovário. Devido à variação entre lotes, colagenase tempo de tratamento pode variar e devem ser cuidadosamente monitorizados através de inspeção visual para garantir defoliculation.
   4. Permitir oócitos para se instalarem no tubo, retire da solução e lave os ovócitos com tampão MBSH (ver Materiais e Métodos).
   5. Repita mais duas vezes para lavar um total de três lavagens. Este protocolo de isolamento de oócitos é semelhante ao detalhado em Cohen et al., 2009.
   6. Classificar manualmente estágio III / IV oócitos (Dumont, 1972) em tampão MBSH sob um microscópio padrão de dissecação. Oócitos fase III estão completamente opaco, mas branco, enquanto ovócitos estágio IV são ligeiramente maiores e salpicado com pigmento. Oócitos que são ligeiramente transparentes são demasiado jovens e ovócitos que totalmente pigmentadas ou apresentam distribuição do pigmento polarizada são muito antigas.
3. Preparação da agulha:
   Puxe e bisel agulhas para um diâmetro externo de ~ 0,05 mm. (Nós usamos Drummond Científico de 3,5 polegadas capilares (ordem # 3-000-203-G / X), um Instrumento de Sutter Co. micropipeta extrator e um WPI Inc. beveller.)

Parte 3: microinjeção

1. Calibrar agulha com DEPC O _2-H para entregar 2 nl por injeção. Nós frente a nossa carga usando uma agulha microinjetor gás-driven (ver Materiais e Métodos), e calibrar o tamanho da gota usando um micrômetro.
2. Carga RNA em agulha.
3. Lugar classificadas oócitos em um prato de injeção contendo tampão MBSH. Nós microinject em um prato com uma camada de espuma de borracha preta. Os oócitos pálida se destacam bem em um backgrou brancond.
4. Cuidadosamente cada injetar oócitos com 2 nl de RNA em 50 nM.
5. Expulsar RNA, lavar a agulha com DEPC O _2-H, e carregar RNA próxima injectável.

Parte 4: Cultura de oócitos

1. Oócitos lugar em um poço de uma placa de 24 estéreis bem (Sigma Aldrich). Nós cultura até mil oócitos por poço.
2. Remover e substituir tampão com 400 mL O ocyte ULTURA C M edium (OCM; ver Materiais e Métodos) por poço. Coloque placa de cultura dentro de um recipiente hermético plástico com toalha de papel molhado para manter o ambiente úmido durante a cultura.
3. Incubar oócitos a 18 ° C para os pontos de tempo que varia entre 8 e 48 horas.

Parte 5: Fixação Desidratação e Armazenamento de Oócitos

1. Resolver quaisquer oócitos mortos e coloque oócitos sobreviventes em frascos de vidro. Forma rotineira,> de sobrevivência de 90%.
2. Oócitos lugar em MEMFA fixadora (ver Materiais e Métodos) e rock por 20 minutos. Proteger os oócitos da luz, cobrindo com papel alumínio.
3. Lavar oócitos, removendo e substituindo fixador com volume igual de tampão MBSH. Repita este lave uma vez mais, num total de duas lavagens.
4. Lavar oócitos em metanol anidro:
   1. Retire metade do volume, substitua com metanol.
   2. Repita o passo "a" duas vezes.
   3. Retire toda a solução, substitua com metanol.
   4. Repita lavar metanol.
5. Oócitos podem ser armazenadas a -20 ° C até que esteja pronto para a imagem.

Parte 6: Imagem de localização RNA por microscopia confocal

1. Antes de imagem, adicionar Médio Murray s Clearing (2:1 álcool benzílico benzoato-benzil) para um fundo de vidro FluoroDish (WPI Inc.) para cobrir a superfície de imagem.
2. Transferir cuidadosamente os oócitos do metanol para a FluoroDish, minimizando o volume de metanol transferidos.
3. Imagem em um microscópio invertido confocal (Nós temos utilizado com sucesso um LSM510 Zeiss e uma Leica TCS SP2).

Figura 1:.. Visualização de Localização RNA Subcelulares pela microinjeção de Transcrições fluorescente etiquetado A. Após a microinjeção, RNA marcado com Alexa Fluor 546 é inicialmente restrita ao núcleo B. Depois de oito horas de cultura, uma RNA fluorescente etiquetado controle pode ser visto de maneira uniforme distribuídos no citoplasma do ovócito. C. No entanto, RNA fluorescente etiquetado contendo seqüências que recrutam as máquinas de transporte pode ser visto no processo de localização subcelular ao pólo vegetal do oócito (para baixo). Barra de escala = 50 mm.

Discussão

Aqui nós apresentamos um protocolo para a visualização de localização mRNA em oócitos Xenopus. Este método, usando transcrições fluorescente etiquetado RNA tem maior relação sinal-ruído do que o anteriormente obtido com marcada com digoxigenina transcrições e é mais simples e mais rápido do que in-situ abordagens baseadas (Mowry e Melton, 1992, Gautreau et al., 1997). Usando este método, podemos engenheiro RNA mutações sequência e rapidamente teste para função in vivo. Além disso, usando adici...

Materiais

Tx tampão 10X

• 60 mM MgCl ₂
• 400 mM Tris-HCl (pH 7,5)
• 20 mM espermidina-HCl

20x mix cap / NTP

• 10 mM CTP
• 10 mM ATP
• 9 mM UTP
• 2 mM GTP
• 20 mM G (ppp) G Cap Analógico (New England Biolabs)

G-50 coluna

• Hidrato de 5 g Sephadex G-50 contas (Sigma Aldrich) em 100 ml deionizada H ₂ O. DEPC de tratamento por 30 min. e autoclave. Loja de ações incompletas em temperatura ambiente. Antes de usar, adicione o seguinte RNase soluções:
• 0,5 ml 0,2 M EDTA
• 1 ml 1 M Tris pH 8,0
• 0,5 ml SDS 20%
• Loja completa G-50 solução a 4 ° C.
• Remover e descartar o êmbolo de uma seringa de 3 ml (BD Biosciences) e colocar o cano da seringa para um tubo cônico de 15 ml (Corning). Ligue a seringa com uma pequena quantidade de lã de vidro (uma ficha cerca de metade do tamanho de uma moeda de um centavo).
• Redemoinho solução G-50 completa para voltar a suspender contas.
• Adicionar 2 ml G-50 solução para a coluna vazia.
• Rodada por 1 minuto a 1000 x g em centrífuga de bancada.
• Adicionar 200 mL DEPC tratados com H ₂ O deionizada para cada coluna. Spin.
• Repita mais duas vezes para lavar um total de três lavagens.
• Remover o corpo da seringa para um novo tubo cônico de 15 ml.

Solução de colagenase

• 75 mg de colagenase Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich)
• 25 ml 0,1 M KPO ₃ + (pH 7,4)

MBSH tampão

• 88 mM NaCl
• 1 mM KCl
• 2,4 mM NaHCO ₃
• 0,82 mM MgSO ₄ 7H ₂ O X
• 0,33 mM Ca (NO _{3) 2} X 4H ₂ O
• 0,41 mM CaCl ₂ X 6H ₂ O
• 10 mM HEPES (pH 7,6)

Meio de Cultura de oócitos

• 50% L15 médio
• 15 mM HEPES (pH 7,6)
• Uma insulina mg / ml
• 100 mg / ml de gentamicina
• 50 nistatina U / ml
• 50 U / ml de penicilina
• 50 mg de estreptomicina / ml

MEMFA solução

• 0,1 M MOPS (pH 7,4)
• 2 mM EGTA
• 1 mM MgSO ₄
• Formaldeído 3,7%

Computação rendimento RNA

• Determine CPM em "input" e "incorporados" amostras usando um contador de cintilação padrão.
• incorporação = ("incorporada") / (10 x "input")
• Valores incorporação típicos variam entre 0,03 e 0,10 ~.
• Rendimentos máximos teóricos para polimerases diferentes:
  T7, T3, SP6 - 2,64 mg
• Rendimento da reação em mg = (rendimento máximo de polimerase usada) X (incorporação)
• Diluir RNA a 50 nM = (mg RNA) / 320 / (comprimento de RNA em bases) / (5X10 ^-8)
• A reação geralmente produz ~ 5-10 mL de RNA em 50 nM.