Usando a resposta optocinético para estudar a função visual de zebrafish

Resumo

Optocinético resposta tem sido amplamente utilizada para avaliar as funções visuais de zebrafish larval. No entanto, o protocolo padrão para larvas de peixes ainda não é facilmente aplicável em adultos ^05/01. Aqui, apresentamos como medir a OKR de zebrafish adultos usando um novo protocolo que é estabelecido em nosso laboratório.

Resumo

Resposta optocinético (OKR) é um comportamento que um animal vibra seus olhos para seguir uma grade rotativa em torno dele. Tem sido amplamente utilizado para avaliar as funções visuais de larvas zebrafish ^1-5. No entanto, o protocolo padrão para larvas de peixes ainda não é facilmente aplicável em zabrafish adulto. Aqui, apresentamos como medir a OKR de peixe-zebra adulto com o nosso aparelho custom-built simples usando um novo protocolo que é estabelecido em nosso laboratório. Tanto os aparelhos como o nosso e passo-a-passo do procedimento OKR no peixe-zebra adulto são ilustrados neste vídeo. Além disso, as medidas do OKR larval, bem como a resposta optomotor (OMR) teste de peixe-zebra adulto, também são demonstradas neste video. Este ensaio OKR de peixe-zebra adulto em nosso experimento pode durar até 4 horas. Teste OKR tais aplicado em peixes adultos serão beneficiados com a investigação da função visual de forma mais eficiente quando o adulto sistema de visão dos peixes é manipulado.

Su-Qi Zou e Wu Yin contribuíram igualmente para este papel.

Protocolo

Parte I: Construir o aparato OKR

Detalhes são mostrados na demonstração em vídeo.

Parte II: OKR de Adultos Zebrafish

Se o seu laboratório construiu um aparelho OKR, a chave de adultos zebrafish OKR é manter o peixe. Nesta parte, vamos mostrar passo a passo.

Nosso aparelho compõe seguintes peças similares para os outros mencionados. A câmara de peixes circular é de 7,0 cm de diâmetro externo, 6,5 cm de diâmetro interno e 7,0 cm de altura. O tambor em torno da câmara de peixe é de 8,5 cm de diâmetro para fora, 7,5 cm de diâmetro interno e 7,0 cm de altura. Poderia girar no sentido horário e anti-horário com a velocidade de 20 ~ 70 rotações por minuto (rpm). Onze ciclos de listras pretas e brancas são desenhadas em um papel vegetal que aderiram na parte externa do tambor. O sistema de iluminação é composto por dois tubos círculo de luz em 21 cm de diâmetro.

Figura 1. O modelo de esponja. O penhasco feitas neste meio é ter certeza de que o campo visual não estava sendo protegido.

1. A esponja, como mostrado na Fig.1 composto por duas partes. A parte esquerda é tamanho 3 cm x 3 cm x largura alta 2 cm. A parte direita é o comprimento 3 cm x 3 cm x largura alto 3 cm.
2. Coloque esta esponja no fundo da câmara de peixe e despeje água criação em cerca de 2 cm de profundidade. Bolha de ar que se escondem na esponja deve ser expulso.
3. Inserir um pino na parte da frente do lado direito da esponja, cerca de 2 mm para trás do precipício.
4. Anestesiar um peixe-zebra adulto na MS-222.
5. Coloque o peixe-zebra na esponja com até dorsal e permitir que um lado da sua barbatana peitoral antes do primeiro pino.
6. O segundo pino é inserido atrás da barbatana peitoral outros. Poderia evitar corpo encolhendo zebrafish, cooperando com o primeiro pino (ver também na figura. 2).
7. Grampo sua cauda com uma artéria grampo e corrigir o clamp da artéria em um pedaço de borracha (massa de modelar), que é respeitado na câmara de peixe.
8. O pino de terceiro e quarto é plantada no local perto de poros cloacal do corpo de peixe. Poderia impedir a onda de zebrafish sua cauda intensamente.
9. O pino de quinta está situada entre o primeiro eo terceiro pino e, em seguida, o pino é sexto no outro lado do mesmo. Eles poderiam impedir zebrafish de tremer seu corpo.
10. O pino de sétimo e oitavo está inserido nos locais perto da brânquia para manter a orientação da cabeça.
11. Despeje a água na câmara de criação de peixes.
12. Depois que o peixe-zebra acorda, deixe-o adaptar para 5 ~ 10 minutos.
13. Ligar a luz deste aparelho e deixe zebrafish adaptar esta iluminação por 2 minutos.
14. Ligue o motor para impulsionar a grade e permitir zebrafish para se adaptar por 1 minuto.
15. Ligue a câmera e gravar o movimento dos olhos.
16. Analisar os ângulos de olho ⁶ e números saccade em seu computador pessoal (Um exemplo representativo da análise ângulos olho é mostrado na Fig.2).

Figura 2. O ângulo entre o eixo dos olhos e eixo do corpo.

a) Quando a direção de ralar é nasal-to-temporal, que definimos o ângulo na frente do corpo do peixe é um ângulo negativo eo ângulo no corpo do peixe é um ângulo positivo, vice-versa (para breve revisão também ver ref. 6). Números nesta figura representam a seqüência de pinos.

b) exemplo de análise OKR de um peixe no grupo normal. Um filme de um segundo foi transferido para uma série de quadros e os ângulos dos olhos de cada quadro foi medida com Image-pro software Plus. Cada ponto nesta figura representa cada quadro medimos.

Notas:

1. Todos os pinos são utilizados apenas para evitar zebrafish de tremer seu corpo, muito apertado será prejudicial para os peixes.
2. Clamp da artéria pode danificar o rabo como sua área de contato é pequena. Uma vez que a cauda é livre, é muito difícil de corrigir este peixe. Enrole uma bandagem em torno da cauda é recomendado em alguma condição.
3. O pino de sétimo e oitavo, que são plantadas no local perto de emalhar não deve ser o abrigo de sua visão de ralar.

Parte III. OKR de Larval Zebrafish

1. Metilcelulose

Larval zebrafish podem ser imobilizadas em solução de metilcelulose a 6%, enquanto manter viva por muito tempo. Preparar a solução de metilcelulose como se segue.

1. Ferva 200 ml DDH ₂ O forno de microondas em cerca de 3 minutos em alto nível.
2. Transferir a água quente para uma placa de agitação e mexa vigorosamente.
3. Adicione 12 g de metilcelulose na água quente aos poucos.
4. Continue mexendo por 3 minutos após a metilcelulose é bem dispersa.
5. Esfriar a soluções com água e gelo até que fique claro, e depois colocá-lo a 4 ° C.

1. Dois pares de macho e uma fêmea de peixe-zebra adulto em um tanque de acasalamento, às 17h00 após a alimentação. Na manhã seguinte, transferi-los para um tanque de acasalamento fresco e coletar embriões após 1 hora.
2. Os ovos são mantidas em meio de embriões em ± 0,5 28,5 ° C uma incubadora com a luz: ciclo escuro das 14h10min.
3. Os ovos serão chocados com menos 48 horas após a fertilização (hpf) eo OKR será testado em 72 hpf ou mais tarde. Neste vídeo, as larvas são menos 5 dpf.

3. Procedimento de OKR

1. Colocar o aparelho sob o estereoscópio equipado com câmera CCD e ligar a luz deste aparelho.
2. Adicionar 20 ml Metilcelulosa 6% numa placa de Petri de 55 mm.
3. Lugar larvas várias vezes seguidas no centro deste prato.
4. Coloque uma bolha de ar sobre um volume de 1 ml no campo da câmera, que poderia ser como um espelho para refletir o sentido da grade.
5. Ligue o motor e gravar o movimento de seus olhos.

Parte IV. OMR do Adulto Zebrafish

Adulto zebrafish OMR também pode ser realizado com este aparelho, basta colocar uma coluna na câmara de peixe para prevenir peixes nadando em centro (mostrado na Fig.3, a velocidade de rotação é de 36 rpm, preto-branco ciclos são 11).

1. Coloque o peixe nesta câmara de peixe.
2. Está uma coluna de 2 cm de diâmetro no centro desta câmara peixes.
3. Adaptar para um minuto, tanto na grade e ainda ralar rotação.
4. Registro do movimento de zebrafish.
5. Analisar a taxa de coincidência de tempo em seu computador pessoal (um exemplo é mostrado na Fig.3b, velocidade de rotação é de 36 rpm, preto-branco do ciclo é de 11)

Figura 3. OMR Zebrafish de Adultos. (A) Uma coluna de plástico branco foi colocado no centro da câmara de peixe para prevenir peixes nadando em toda ela. (B) A taxa de coincidência de zebrafish adultos após a grade. A taxa de coincidência foi definida como a proporção do tempo de ralar a seguir para o tempo de gravação total. O valor de 50% indica que o peixe está nadando aleatoriamente, enquanto 100% indica a grade seguintes peixes muito bem. Ambos os nervos ópticos foram esmagados com pinça de jóias de cerca de 10 segundos. O comportamento de OMR apareceu como uma piscina aleatória após esmagamento.

Discussão

De acordo com a definição de OKR, é um fenômeno que os animais se movem os olhos para seguir uma grade rotativa espontaneamente. Se esse comportamento tem sido conduzido por um longo tempo (por exemplo, acima de 6 horas), os músculos do olho pode estar cansado e OKR será atenuada.

Adulto zebrafish OMR tem sido descrito completamente por outros ^7. Neste vídeo, nós apenas mostrar-lhe esse comportamento com o nosso aparelho. Uma vez que os nervos ópticos são esmagados, eles não poder...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Metilcelulose	Sigma-Aldrich	M6385	Viscosidade 25 cP